原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血IL-35的表達(dá)及其與Treg細(xì)胞之間的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　1.探討白細(xì)胞介素-35(IL-35)在原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者外周血中的表達(dá)水平及其與肝功能、AMA滴度、IgM水平之間的關(guān)系。
　　2.明確IL-35兩個(gè)亞基EBI3和IL-12p35與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)功能性標(biāo)志Foxp3之間的關(guān)系。
　　3.明確IL-35是否由Tregs分泌及其不同活化狀態(tài)下IL-35表達(dá)水平的變化。
　　4.明確PBC患者外周血中是否存在Tregs頻率降低及

2、肝組織損傷與Tregs的關(guān)系。
　　方法：
　　1.采集37例PBC患者，20例正常對(duì)照(NC)外周血血清，用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)IL-35的表達(dá)水平，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)肝功能，半自動(dòng)血凝儀檢測(cè)凝血功能，免疫熒光印跡法檢測(cè)AMA、IgM，分析PBC患者IL-35的表達(dá)水平，并與部分肝功能指標(biāo)，INR及AMA滴度、IgM水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.采集15例Ⅰ/Ⅱ期PBC患者和22例Ⅲ/Ⅳ期PBC患者和15例

3、NC外周抗凝血5 ml，獲取PBMC，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組EBI3、IL-12p35及Foxp3的mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3.磁珠分選獲得CD4+CD25+ Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞，加入抗CD3、抗CD28抗體和IL-2進(jìn)行刺激，在不同的時(shí)間點(diǎn)（0、3、5、7天），流式細(xì)胞術(shù)(FCM)鑒定分離的CD4+CD25+ Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞純度，RT-PCR檢測(cè)E

4、BI3、IL-12p35、Foxp3的mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-35、IL-10和TGF-β的表達(dá)水平，分析不同活化狀態(tài)下IL-35的表達(dá)水平變化情況。
　　4.通過(guò)FCM檢測(cè)24例PBC患者外周血中的CD4+CD25+ Tregs頻率，分析Tregs是否存在頻率降低。
　　5.對(duì)20例患者進(jìn)行肝活檢，留取肝組織，采用免疫熒光組織化學(xué)法檢測(cè)胞內(nèi)Foxp3的表達(dá)，分析Foxp3的表達(dá)情況。

5、>　　結(jié)果：
　　1.PBC患者血清中IL-35的表達(dá)水平與NC無(wú)明顯差別（P＞0.05），Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期PBC患者組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;血清中IL-35的表達(dá)水平與ALT、AST、GGT、ALP、TBIL呈正相關(guān)，與ALB呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與INR、AMA滴度、IgM水平無(wú)相關(guān)(P＞0.05)。
　　2.PBC患者外周血中EBI3、IL-12p35和Foxp3的mRNA表達(dá)水平與NC無(wú)明顯差別，

6、Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期PBC患者組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); EBI3、IL-12p35與Foxp3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(P＜0.05)，EBI3與IL-12p35mRNA表達(dá)水平也呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　3.未活化和活化的CD4+CD25+ Tregs均可檢測(cè)到EBI3、IL-12p35、Foxp3的mRNA，且其表達(dá)水平伴隨著活化時(shí)間延長(zhǎng)而升高（P＜0.05）。活化的CD4+CD25+Tregs培養(yǎng)上清中I

7、L-35、IL-10和TGF-β的表達(dá)水平伴隨著活化時(shí)間延長(zhǎng)而升高(P＜0.05)。
　　4.PBC患者外周血CD4+CD25+ Tregs頻率低于NC，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期PBC患者組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.PBC患者肝組織炎癥區(qū)Foxp3表達(dá)顯著升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)可能與肝組織炎癥活動(dòng)度相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.PBC患者外周血IL-35的表達(dá)水平伴隨著

8、肝臟炎癥、壞死程度的加重，肝臟合成能力的降低而升高，與AMA滴度和IgM水平無(wú)明顯相關(guān)。
　　2.IL-35兩亞基與Tregs的功能性標(biāo)志Foxp3呈正相關(guān);CD4+CD25+ Tregs表達(dá)并分泌IL-35，且其表達(dá)水平伴隨著Tregs活化時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，IL-35是Tregs分泌的一類(lèi)抑制性細(xì)胞因子。
　　3.PBC患者外周血中CD4+CD25+ Tregs頻率降低，但與疾病階段無(wú)關(guān);肝組織炎癥區(qū)可見(jiàn)Foxp3表達(dá)，可