檉柳eIF5A基因的抗逆功能研究.pdf

1、干旱、鹽堿脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素,應(yīng)用基因工程手段對(duì)植物進(jìn)行遺傳改良已成為提高植物抗逆性的有效途徑。研究抗逆相關(guān)基因的抗逆功能是基因工程抗性育種的前提。eIF5A是目前發(fā)現(xiàn)的惟一含有特殊氨基酸(hypusine)殘基的蛋白質(zhì),其具體的生物學(xué)功能尚不清楚。已有研究表明,eIF5A參與植物細(xì)胞的諸多生命活動(dòng),并參與植物的抗逆反應(yīng)。為研究eIF5A基因的功能,本研究對(duì)來自檉柳的eIF5A基因(TaeIF5A)的表達(dá)和功能進(jìn)行了初步研

2、究。
　　 利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù),對(duì)不同脅迫條件下TaeIFSA基因在檉柳中的時(shí)序表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,TaeIFSA基因能夠應(yīng)答NaCl、PEG、NaHCO3、CdCl2以及ABA脅迫,不同脅迫條件下TaeIFSA基因的表達(dá)模式各不相同,并且具有一定的組織器官表達(dá)特異性。利用基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù),將TaeIF5A-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá),在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都觀察到綠色熒光,說明TaeIF5A表達(dá)定

3、位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
　　 利用TAIL-PCR技術(shù),克隆得到長(zhǎng)度為1550bp的TaeIFSA啟動(dòng)子。序列分析表明,該啟動(dòng)子區(qū)包含多種與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,如MYB、MYC、GTI、WRKY等。將elF5A啟動(dòng)子構(gòu)建到pCAMBIA1301中,使其驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá),將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草,GUS染色顯示轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)表達(dá)的煙草外植體有藍(lán)色斑點(diǎn),表明該啟動(dòng)子具有啟動(dòng)表達(dá)的活性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花

4、法轉(zhuǎn)化擬南芥,通過對(duì)種子的潮霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化擬南芥,GUS染色結(jié)果表明,eIF5A基因主要在根部表達(dá),在葉片中也有少量表達(dá)。
　　 將TaeIFSA構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2中,重組質(zhì)粒pYES2-TaeIFSA轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl,比較重組和非重組酵母在NaCl、KCl、MgCl2、ZnCl2、CuSO4、CdCl2、H202、山梨醇、Na2CO3和NaHCO3脅迫下的生長(zhǎng)狀況,驗(yàn)證TaeIFSA對(duì)不同非生物脅迫的抵

5、抗能力。結(jié)果表明TaeIFSA對(duì)包括鹽、鹽堿、干旱、過氧化物以及重金屬在內(nèi)的多種脅迫具有抵抗能力。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證逆境脅迫下TaeIFSA基因的功能,將TaeIFSA基因構(gòu)建到35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pROKⅡ,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化山新楊。PCR、Southern雜交和Northern雜交檢測(cè)表明TaeIFSA基因整合到山新楊基因組中,并能夠表達(dá)。選取10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系組培苗進(jìn)行了0.6％NaCl脅迫試驗(yàn),比較非轉(zhuǎn)基因

6、和轉(zhuǎn)基因山新楊地上和地下部分的長(zhǎng)度,結(jié)果表明TaeIFSA基因提高了山新楊的耐鹽能力,其中轉(zhuǎn)基因株系L2和L3耐鹽表現(xiàn)較其它各株系好。對(duì)L2、L3和非轉(zhuǎn)基因山新楊組培苗進(jìn)行ZnCl2、CuSO4、CdCl2、山梨醇及NaHCO3脅迫試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因山新楊在含5mMNaHCO3的培養(yǎng)基中無法生長(zhǎng)而死亡,對(duì)非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因山新楊的根長(zhǎng)和高度的比較表明,TaeIFSA基因不同程度的提高了山新楊對(duì)重金屬和干旱的耐受能力。將非轉(zhuǎn)基因和1

7、0個(gè)轉(zhuǎn)基因株系移栽至大棚,待樹高達(dá)到約60～70cm時(shí)對(duì)其進(jìn)行0.8％NaCl,分析鹽脅迫條件下非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因山新楊的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性以及相對(duì)電導(dǎo)率的變化。結(jié)果表明,鹽脅迫下,多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性比非轉(zhuǎn)基因山新楊高,而相對(duì)電導(dǎo)率低于非轉(zhuǎn)基因山新楊。此外,通過對(duì)鹽脅迫下非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因各株系的相對(duì)高生長(zhǎng)和地徑增長(zhǎng)的比較發(fā)現(xiàn),多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)生長(zhǎng)量高于非轉(zhuǎn)基因山新楊,說明TaeI

8、FSA基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因山新楊的耐鹽能力。
　　 為探索TaeIF5A表達(dá)的分子機(jī)制,首先構(gòu)建了檉柳cDNA文庫,并轉(zhuǎn)化到酵母中。并將TaeIFSA基因構(gòu)建到Bait載體,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選檉柳cDNA文庫中與TaeIF5A相互作用的蛋白。共獲得了6個(gè)與TaeIF5A互作的蛋白,其中3個(gè)通過進(jìn)一步驗(yàn)證證明其具有相互作用,一個(gè)是未知功能蛋白,一個(gè)是與細(xì)胞生長(zhǎng)和延伸有關(guān)的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶(XTHs)前體蛋白,另一

9、個(gè)是與生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)有關(guān)的ARF GTP酶激活子。TaeIF5A與木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶前體蛋白和ARF GTP酶激活子蛋白發(fā)生互作,說明TaeIF5A可能在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變化以及植物對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮作用,但其互作的具體過程及意義還有待于進(jìn)一步研究。
　　 選擇TaeIFSA啟動(dòng)子中與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,GT-1、MYC/E-box和W-box,分別將它們的序列以3次串聯(lián)重復(fù)的形式構(gòu)建到報(bào)

10、告載體pHIS2中,利用酵母單雜交系統(tǒng)篩選TaeIFSA基因的上游調(diào)控基因。其中,篩選到可能與GT-1順式作用元件互作的6個(gè)基因。其中,有4個(gè)蛋白是與葉綠體相關(guān)的蛋白,其它的兩個(gè)分別是參與DNA修復(fù)的泛素結(jié)合酶,另一個(gè)是在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。篩選獲得了7個(gè)可能與MYC/E-box順式作用元件互作的基因,其中有4個(gè)是與光合作用相關(guān)的蛋白;除一個(gè)未知功能蛋白外,另外兩個(gè)分別是羥甲基谷酰輔酶A還原酶,它是異戊二

11、烯代謝途徑中的限速酶;參與識(shí)別并結(jié)合DNA激活轉(zhuǎn)錄過程的RNA聚合酶β'亞基。獲得了5個(gè)可能與W-box順式作用元件互作的蛋白,其中一個(gè)是與植物干早、高鹽和低溫等逆境抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP2轉(zhuǎn)錄因子;一個(gè)是與生物體DNA復(fù)制過程密切相關(guān)的MCMs家族中重要的一員,微小染色體維系蛋白3;另一個(gè)是果糖二磷酸醛縮酶,它是植物光合作用和呼吸作用中的關(guān)鍵酶之一;還有對(duì)泛素化修飾的特異性和精確時(shí)空性起關(guān)鍵作用的泛素結(jié)合酶E2;此外,與MYC/E-b