As2O3膀胱灌注方案中CX43半通道開放和表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　BCG膀胱灌注為淺表性膀胱癌免疫治療的金標(biāo)準(zhǔn)。但部分病人療效差。不能耐受毒性。尋找與之聯(lián)用以提高療效減少副作用的藥物是待解決的問題。我們已發(fā)現(xiàn)As2O3治療膀胱癌有效，其主要機(jī)制為氧化應(yīng)激反應(yīng)，已知氧化應(yīng)激反應(yīng)可促進(jìn)Cx43半通道開放，半通道的開放可上調(diào)細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)。據(jù)此提出Cx43半通道可介導(dǎo)As2O3上調(diào)BCG免疫反應(yīng)中關(guān)鍵因子IL-6的表達(dá)提高療效。本課題擬通過觀察BCG與As2O3對(duì)膀胱癌細(xì)胞Cx43

2、表達(dá)和半通道開放的影響，并檢測(cè)IL-6等相關(guān)小分子改變，來進(jìn)一步明確二者對(duì)膀胱癌作用的新機(jī)制及兩者間的交互調(diào)節(jié)。論證Cx43半通道作為BCG免疫反應(yīng)及As2O3誘導(dǎo)氧化應(yīng)激兩個(gè)抗腫瘤機(jī)制的交叉點(diǎn)，可通過調(diào)節(jié)其開放使兩種藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，互相增強(qiáng)抗腫瘤效果的假說。可為BCG聯(lián)合As2O3治療膀胱癌提供理論基礎(chǔ)，有助于制定科學(xué)合理的灌注方案，提高治療膀胱癌的效果。
　　方法：
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　培養(yǎng)條件為37℃，5％C

3、O2，培養(yǎng)基成分:DMEM并且含有10％胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)使用25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每2天換液一次，每3天可進(jìn)行傳代操作。
　　二、CCK8法:檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　(1)單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板;10000細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量100微升，37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。藥物作用24h、48h、72h。加CCK-8標(biāo)準(zhǔn)液100μl。作用1h。酶標(biāo)儀檢測(cè)。記錄結(jié)果，
　　三、LDH試劑盒對(duì)細(xì)胞外LDH濃度的檢測(cè)

4、
　　1％DMEM鋪96孔板，10000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24h。藥物作用一段時(shí)間。取50ul上清，用緩沖液提前配制底物每孔50ul加入相應(yīng)孔中，室溫孵育30min，避光，每孔加入50ul的終止液，上機(jī)檢測(cè)，波長490nm根據(jù)OD值計(jì)算比值。
　　四、細(xì)胞外GSH濃度的檢測(cè)
　　1％DMEM鋪96孔板，10000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24h。藥物作用一段時(shí)間。取50ul上清，提前溶解Reconstitution Buffer wi

5、th esterase和reconstituted LuciferinDetection Reagent，按1∶1體積混合，按每孔50ul加入相應(yīng)孔中。室溫15min，避光，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，根據(jù)OD值計(jì)算比值。
　　五、細(xì)胞外ATP濃度的檢測(cè)
　　1％DMEM鋪96孔板，10000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24h。藥物作用一段時(shí)間。取50ul上清，提前溶解ATP Detection Buffer和ATP Detection Substra

6、te，兩者按1∶1體積混合，按每孔50ul加入相應(yīng)孔中。室溫5-60min，避光，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，根據(jù)OD值計(jì)算比值。
　　半通道特異性阻斷劑GAP26，100umol/L，提前12h預(yù)處理膀胱癌細(xì)胞，再次檢測(cè)As2O3作用CX43蛋白表達(dá)及培養(yǎng)基中小分子水平變化。
　　六、Western Blot:檢測(cè)蛋白的表達(dá)
　　收集蛋白樣品。蛋白質(zhì)電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜。封閉，一抗孵育，洗膜，開始孵育二抗，室溫25℃孵育1小時(shí)后洗滌

7、PVDF膜，5min/次，4次。準(zhǔn)備發(fā)光。
　　結(jié)果：
　　使用不同濃度的As2O3刺激BIU-87細(xì)胞24h、48h、72h后可發(fā)現(xiàn)As2O3對(duì)BIU-87細(xì)胞的生存率有明顯的影響。在細(xì)胞膜保持完整的情況下20umol的As2O3刺激BIU-87細(xì)胞6h后可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中小分子GSH、ATP濃度增加，同一條件下使用100umol的CX43半通道阻滯劑GAP26預(yù)處理BIU-87細(xì)胞發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中小分子GSH、ATP濃度增加幅