Cx43蛋白表達(dá)在腦血管痙攣細(xì)胞模型中的研究.pdf

1、目的：前期研究表明，縫隙連接在腦血管痙攣中發(fā)揮重要作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在細(xì)胞水平探討縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的改變及對(duì)其腦血管痙攣的影響。 方法：一、利用組織貼塊法原代培養(yǎng)的兔腦基底動(dòng)脈平滑肌及血管成纖維細(xì)胞，用光學(xué)相差顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。二、Cx43沉默病毒載體的建立；用pGC-Cx43-scilencer質(zhì)粒對(duì)JM109菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后采用質(zhì)粒DNA純化擴(kuò)增系統(tǒng)對(duì)pGC—Cx43-scilencer質(zhì)粒進(jìn)行鑒定及擴(kuò)

2、增。質(zhì)粒交由生物公司合成Ad5-Cx43-shRNA-GFP載體。用該病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，用熒光顯微鏡下觀察感染后的細(xì)胞GFP的表達(dá)及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)感染效率.三、腦血管痙攣細(xì)胞模型的建立：分別建立Fujii細(xì)胞模型及我們首創(chuàng)的共培養(yǎng)細(xì)胞模型。四、對(duì)上述兩種模型分別用10-6M的OxyHb孵育24、48、72、96小時(shí)后用western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察Cx43蛋白的變化、HE染色后在光鏡下采用雙盲法觀察平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度變化

3、。五、對(duì)Cx43進(jìn)行RNAi干擾：其中Fujii細(xì)胞模型直接干擾平滑肌細(xì)胞，而立體共培養(yǎng)模型則只干擾血管成纖維細(xì)胞，觀察OxyHb誘導(dǎo)的Cx43蛋白的改變及對(duì)平滑肌長(zhǎng)度的影響，記錄結(jié)果，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：一、1、培養(yǎng)的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定： 1)、在相差倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，1周左右可見有細(xì)胞自組織塊周邊游出，細(xì)胞呈梭形或長(zhǎng)梭形。2～3周后原代細(xì)胞融合成片，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞呈單層及多層重疊

4、成長(zhǎng)，為典型的峰谷狀。以上觀察符合動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；2)、抗α—actin抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，95％培養(yǎng)的細(xì)胞染色陽(yáng)性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞而且純度較高。2、血管成纖維細(xì)胞的鑒定：1)在相差倒置顯微鏡下觀察，3天左右有細(xì)胞自組織塊周圍游出，細(xì)胞呈多角形，1-2周后原代細(xì)胞融合成片，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞呈旋渦狀生長(zhǎng)，符合成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特征，。 二、獲得的質(zhì)粒目的片段經(jīng)序列測(cè)定與所提供片段相符合，所得到的

5、腺病毒載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干擾后效果明顯，GFP持續(xù)表達(dá)大于96小時(shí)，Cx43蛋白干擾后在表達(dá)呈陰性。 三、Fujii細(xì)胞模型中，在OxyHb孵育24、48、72、96小時(shí)后，其長(zhǎng)度分別為37.57±18.12um、34.604±17.33um、30.18±20.86um、44.35±19.74um與正常對(duì)照組64.46±24.36um相比較平滑肌細(xì)胞明顯縮短，收縮率分別為41.71％、46.32％、53.18％、31.20％(P＜0

6、.05)，且在24小時(shí)組及96小時(shí)組細(xì)胞長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于72小時(shí)組(P＜0.05)。western blot顯示平滑肌受到OxyHb孵育后，Cx43在24-96小時(shí)內(nèi)其值分別為3.487±0.122、4.835±0.083、6.636±0.135、4.803±0.058與正常對(duì)照組1.988±0.075相比，平滑肌細(xì)胞的Cx43蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，其升高率分別為75.40％、143.20％、233.80％、141.60％，24

7、-72小時(shí)為遞增趨勢(shì)(P＜0.05)。96小時(shí)與72小時(shí)組相比明顯下降(P＜0.05)，在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中顯示，Cx43在平滑肌細(xì)胞中的陽(yáng)性指數(shù)在24-96小時(shí)分別為1.88±0.21、2.52±0.55、2.87±0.32、2.36±0.38，相對(duì)正常對(duì)照組的陽(yáng)性指數(shù)1.35±0.13相比，Cx43增多分別為39.26％、86.67％、112.59％、74.81％，明顯升高(P＜0.05)，且96小時(shí)組明顯低于72小時(shí)組(P＜0.0

8、5)。在立體共培養(yǎng)模型中，在OxyHb孵育OxyHb孵育血管成纖維細(xì)胞后24、48、72小時(shí)后，平滑肌長(zhǎng)度分別為42.45±25.28um、38.27±22.33um、33.65±21.23um與正常正常對(duì)照組65.25±20.33um相比，收縮率分別為34.94％、41.35％、48.43％，痙攣明顯(P＜0.05)，且24-72小時(shí)組細(xì)胞長(zhǎng)度呈遞減趨勢(shì)(P＜0.05)，非直接接觸組2.13±27.35um、條件對(duì)照組64.38±18

9、.22um，與正常對(duì)照組相比無明顯痙攣(P＞0.05)。western blot顯示以O(shè)xyHb孵育血管成纖維細(xì)胞后，平滑肌細(xì)胞的Cx43的相對(duì)含量分別為3.558±0.087、4.533±0.042、5.675±0.226與正常對(duì)照組正常對(duì)照組1.937±0.121相比，Cx43的表達(dá)分別增高83.69％、134.21％、193.99％，增高趨勢(shì)明顯(P＜0.05)，且在24—72小時(shí)內(nèi)呈遞增趨勢(shì)。非直接接觸組1.857±0.110、

10、條件對(duì)照組1.968±0.076與正常對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)。免疫細(xì)胞熒光顯示OxyHb孵育血管成纖維細(xì)胞后，平滑肌細(xì)胞的Cx43陽(yáng)性指數(shù)OxyHb孵育后24小時(shí)組1.89+0.55、OxyHb孵育后48小時(shí)組2.33±0.62、OxyHb孵育后72小時(shí)組2.60+0.22、非直接接觸組1.28±0.15、條件對(duì)照組1.37±0.30，其中24、48、72小時(shí)組陽(yáng)性指數(shù)教正常對(duì)照組分別升高37.96％、70.07％、89.78

11、％，增高趨勢(shì)明顯(P＜0.05)，且24－72小時(shí)呈遞增趨勢(shì)(P＜0.05)。非直接接觸組及條件對(duì)照組與正常對(duì)照組無明顯差異。 四、Fujii細(xì)胞模型在對(duì)平滑肌進(jìn)行RNA干擾后的細(xì)胞在OxyHb孵育24、48、72、96小時(shí)后細(xì)胞長(zhǎng)度分別為僅干擾組62.78±30.15、干擾后OxyHb孵育24小時(shí)組53.77±23.13、干擾后OxyHb孵育48小時(shí)組50.35±25.78、干擾后OxyHb孵育72小時(shí)組50.07±18.75

12、、干擾后OxyHb孵育96小時(shí)組54.27±26.34、相對(duì)于未做RNA干擾的相同時(shí)間段的平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度痙攣程度得到顯著抑制；Ad5-EGFP OxyHb孵育72小時(shí)組31.28±17.44與OxyHb孵育72小時(shí)組30.18±20.86，無顯著差異(P＞0.05)，與正常對(duì)照組64.46±24.36收縮明顯(P＜0.05)。通過western blot檢測(cè)Cx43蛋白，其相對(duì)含量分別為僅干擾組0、干擾后OxyHb孵育24小時(shí)組1.62

13、4±0.080、干擾后OxyHb孵育48小時(shí)組1.657±0.157、干擾后OxyHb孵育72小時(shí)組1.701±0.223、干擾后OxyHb孵育96小時(shí)組1.473±0.167、Ad5-EGFP對(duì)照OxyHb孵育96小時(shí)組4.533±0.132、正常對(duì)照組1.988±0.275、OxyHb孵育96小時(shí)組4.803±0.058。在接受RNA干擾的各組平滑肌細(xì)胞的Cx43的表達(dá)與正常對(duì)照組無明顯差異，與OxyHb孵育96小時(shí)組差異顯著(P＜

14、0.01)。Ad5-EGFP OxyHb孵育96小時(shí)組與OxyHb孵育96小時(shí)組無明顯差異(P＞0.05)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)Cx43陽(yáng)性指數(shù)的檢測(cè)，僅干擾組O、干擾后OxyHb孵育24小時(shí)組1.03±0.22、干擾后OxyHb孵育48小時(shí)組1.12±0.17、干擾后OxyHb孵育72小時(shí)組1.33±0.33、干擾后OxyHb孵育96小時(shí)組1.25±0.16、Ad5—EGFP對(duì)照OxyHb孵育96小時(shí)組2.43±0.45、正常對(duì)照組1.

15、35±0.13、OxyHb孵育96小時(shí)組2.36±0.38。在接受Cx43RNA干擾的各組平滑肌細(xì)胞與正常對(duì)照組相比僅干擾組0、干擾后OxyHb孵育24小時(shí)組干擾后OxyHb孵育48小時(shí)組、明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，干擾后OxyHb孵育72小時(shí)組干擾后及OxyHb孵育96小時(shí)組與正常對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)。Ad5-EGFP OxyHb孵育96小時(shí)組與OxyHb孵育96小時(shí)組無明顯差異(P＞0.05)，與正常對(duì)照組差異

16、顯著(P＜0.05)。在立體共培養(yǎng)模型中，在對(duì)血管成纖維細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾再給予OxyHb孵育，其平滑肌長(zhǎng)度為：僅干擾組62.15±24.87、干擾后OxyHb孵育24小時(shí)組58.13±25.22、干擾后Oxynb孵育48小時(shí)組53.25±16.87、干擾后OxyHb孵育72小時(shí)組52.16±20.15、Ad5-EGFPOxyHb孵育72小時(shí)組31.28±18.33、正常對(duì)照組65.25±20.33、OxyHb孵育72小時(shí)組33.65±

17、21.23，接受Cx43 RNA干擾的各組細(xì)胞的長(zhǎng)度均較同時(shí)間段未給予RNA干擾的細(xì)胞長(zhǎng)度增長(zhǎng)(P＜0.05)。Ad5-EGFP OxyHb孵育72小時(shí)組細(xì)胞長(zhǎng)度與OxyHb孵育72小時(shí)組無明顯差異(P＞0.05)，與正常對(duì)照組差異明顯(P＜0.05)。 結(jié)論；1、OxyHb對(duì)基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞有收縮作用。2、腦血管痙攣時(shí)，基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的Cx43蛋白含量明顯升高，并且呈時(shí)間依賴性。3.在對(duì)其進(jìn)行RNAi后，其含量明顯下降，