糖尿病腎病大鼠腎小球電荷屏障的變化及化瘀通絡(luò)中藥不同配伍的干預(yù)作用.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，是終末期腎?。╡nd stage renal disease, ESRD）的主要原因之一，給社會和家庭帶來沉重負擔(dān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏有效的延緩糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的方案。中醫(yī)藥是我國臨床醫(yī)療的一大特色，近年來在治療腎臟疾病方面取得了很好的療效。目前多數(shù)中醫(yī)腎病專家認為，糖尿病腎病的基本病機除糖尿病原有的“氣陰兩虛”外，“瘀血阻絡(luò)”可能是該病病

2、機之關(guān)鍵。經(jīng)臨證反復(fù)篩選，化瘀通絡(luò)中藥已成為我們治療糖尿病腎病遣方用藥的重要組成部分。
　　蛋白尿是糖尿病腎病早期最重要的臨床表現(xiàn)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實，原尿的形成必須通過腎小球的內(nèi)皮細胞、基底膜（glomerular basement membrane, GBM）和足細胞，這三層結(jié)構(gòu)稱為腎小球濾過屏障。腎小球濾過屏障具有分子屏障和電荷屏障功能，任一屏障功能損傷均會產(chǎn)生蛋白尿。正常狀態(tài)下，帶陰電荷的血漿白蛋白幾乎完全不能通過腎小球濾過屏障

3、，而當(dāng)濾過屏障陰電荷減少時，即使其結(jié)構(gòu)完整，也會出現(xiàn)蛋白尿。本研究擬通過瘀血阻絡(luò)證相關(guān)實驗室指標(biāo)檢測及 DN腎損傷相關(guān)檢測驗證化瘀通絡(luò)中藥治療DN的合理性及有效性，并通過體內(nèi)及體外實驗探討化瘀通絡(luò)中藥對DN蛋白尿的治療作用是否與保護腎小球電荷屏障有關(guān)，以及化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對DN作用的差異。
　　方法：
　　1化瘀通絡(luò)中藥及其不同配伍對糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡(luò)證相關(guān)實驗室指標(biāo)的干預(yù)作用
　　75只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周

4、，隨機選取10只做為正常對照組（C組），其余大鼠予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，4周后造模大鼠按照35mg/kg腹腔注射1％鏈脲佐菌素（streptozocin, STZ），72小時后測隨機血糖≥16.7 mmol/L者為糖尿病造模成功。將成模大鼠60只隨機分為模型組（M組）15只，全方組（Q組，由丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎組成）15只，化瘀組（H組，由丹參、川芎組成）15只，通絡(luò)組（T組，由地龍、水蛭、全蝎組成）15只。造模成功后開始給藥，中藥

5、給藥量：丹參1.35 g/kg、川芎1.08 g/kg、地龍0.9 g/kg、水蛭0.54 g/kg、全蝎0.54 g/kg；正常對照組及模型組給予等量飲用水灌胃。每日1次，共16周。第16周末大鼠尾靜脈取血，檢測糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c, HbA1c）。麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血，檢測血糖、血脂、血常規(guī)、血凝，并留取血液 ELISA法檢測血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）、血小板α顆

6、粒膜糖蛋白CD62p含量。
　　2化瘀通絡(luò)中藥及其不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎損傷的干預(yù)作用
　　90只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機選取10只做為正常對照組（C組），其余大鼠造模方法同前。將成模大鼠74只隨機分為模型組（M組）15只，厄貝沙坦組（Irbesartan, I組）14只，全方組（Q組）15只，化瘀組（H組）15只，通絡(luò)組（T組）15只，干預(yù)方法同前。注射STZ72h后（0周）及給藥第2、4、8、12、16周末記錄各

7、組大鼠進食量，飲水量，代謝籠收集大鼠24h尿液，ELISA法檢測尿蛋白濃度。第16周末，大鼠稱體重，麻醉后腹主動脈取血，檢測肝腎功能；取出右腎稱重，將部分腎組織分別放入FAA固定液和4%戊二醛固定液中，待行光鏡和透射電鏡病理學(xué)檢測。
　　3化瘀通絡(luò)中藥及其不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎小球電荷屏障的干預(yù)作用
　　90只SD大鼠造模及干預(yù)方法同前。第16周末留取大鼠隨機尿，麻醉大鼠后，腹主動脈取血，留取腎皮質(zhì)凍存，采用Real-T

8、ime PCR，Western Blot檢測腎組織HSPG、HPA、PCX、GLEPP1表達；取部分腎皮質(zhì)置于4%中性甲醛固定液中，待行免疫組織化學(xué)檢測；將右腎下極浸泡在陽離子示蹤劑0.5%聚乙烯亞胺（polyethylenimine, PEI）中，透射電鏡檢測GBM陰離子位點（anionic sites, AS）。
　　4化瘀通絡(luò)中藥對高糖環(huán)境下足細胞電荷屏障相關(guān)蛋白的干預(yù)作用
　　33℃、含γ-干擾素DMEM-F12完全

9、培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠足細胞，當(dāng)足細胞增殖至足夠數(shù)量時，更換為不含γ-干擾素的培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱使細胞分化。依照MTT法篩選出的化瘀通絡(luò)中藥含藥血清最佳濃度，將足細胞分為正常糖組（NG組）、高糖組（HG組）、高滲組（MG組）和中藥組（ZG組）。各組分別給予相應(yīng)干預(yù)24h、48h、72h后，收集細胞，采用免疫細胞化學(xué)及Real-Time PCR，Western Blot檢測足細胞PCX、GLEPP1表達。
　　結(jié)果：
　　1化瘀

10、通絡(luò)中藥及其不同配伍對糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡(luò)證相關(guān)實驗室指標(biāo)的干預(yù)作用
　　1.1大鼠一般情況
　　注射STZ72 h內(nèi)造模大鼠死亡3只，2只血糖不達標(biāo)，予以剔除。灌胃16周內(nèi)，M組、Q組、H組各有3只，T組2只大鼠血糖自行恢復(fù)，予以剔除；各組大鼠死亡情況為C組1只，M組5只，Q組3只，H組4只、T組3只。
　　1.2糖化血紅蛋白檢測
　　C組大鼠HbA1c均＜3.0%；與C組相比，造模各組HbA1c均升高；造模

11、各組之間HbA1c無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　1.3空腹血糖、血脂檢測
　　與C組相比，造模各組FBG均顯著升高（P＜0.01）；造模各組之間FBG無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　與 C組相比，造模各組 CHO均顯著升高（P＜0.01）；造模各組之間CHO無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相比，M組TG升高（P＜0.01）；與M組相比，Q組、H組、T組TG均下降（P＜0.05）；Q組、H組、T組之間無統(tǒng)計

12、學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相比，M組HDL-C升高（P＜0.01）；與M組相比，Q組、H組HDL-C無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05），T組HDL-C下降（P＜0.05）。與C組相比，M組LDL-C升高（P＜0.01）；與M組相比，Q組、T組LDL-C下降（P＜0.05），H組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相比，M組VLDL-C升高（P＜0.01）；與M組相比， Q組、H組、T組VLDL-C均下降（P＜0.01或0.05）；與Q組相

13、比，H組、T組VLDL-C均升高（P＜0.05）。
　　1.4血小板參數(shù)檢測
　　各組PLT無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相比，M組MPV增大（P＜0.05）；與M組相比，Q組、H組、T組MPV減小（P＜0.05）；Q組、H組、T組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。各組PCT無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相比，M組PDW增大（P＜0.05）；與M組相比，Q組PDW減?。≒＜0.05），H組、T組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥

14、0.05）。
　　1.5血凝檢測
　　與C組相比，M組大鼠PT明顯縮短（P＜0.01），Q組、T組較M組延長（P＜0.05）；與C組相比，各組大鼠INR均明顯降低（P＜0.01），各組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與C組相比，M組大鼠APTT明顯縮短（P＜0.01），Q組較M組延長（P＜0.05）；各組大鼠TT無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與C組相比，造模各組大鼠FIB水平升高（P＜0.05），造模各組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（

15、P＞0.05）；與C組相比，M組大鼠AT-III活性明顯降低（P＜0.01），Q組、H組、T組較M組升高（P＜0.05）。1.6 ELISA檢測血漿vWF、CD62p含量
　　與 C組相比，M組大鼠血漿 vWF明顯升高（P＜0.01），Q組、H組、T組較M組降低（P＜0.05），Q組、H組、T組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　與C組相比，M組大鼠血漿CD62p含量明顯增多（P＜0.01）；與M組相比，Q組、H組、T組

16、減少（P＜0.05）；與Q組相比，H組增多，T組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　2化瘀通絡(luò)中藥及其不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎損傷的干預(yù)作用
　　2.1大鼠一般情況
　　與同時間點 C組相比，造模各組大鼠進食量、飲水量、尿量均顯著增加（P＜0.01）；造模各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　2.224小時尿蛋白定量（24h UPE）檢測
　　DM成模3天后檢測各組大鼠24h UPE無統(tǒng)計學(xué)差異（P

17、≥0.05）。第2周末與同時間點C組相比，M組24h UPE升高（P＜0.05）；與同時間點M組相比，I組、Q組降低（P＜0.05）。第4周末與同時間點C組相比，造模各組24h UPE均升高（P＜0.01或0.05）；與同時間點M組相比，I組、Q組降低（P＜0.05）。第8周末與同時間點C組相比，造模各組24h UPE均升高（P＜0.01或0.05）；與同時間點M組相比，各治療組降低（P＜0.05）。第12、16周末與同時間點 C組相比

18、，造模各組24h UPE均顯著升高（P＜0.01）；與同時間點M組相比，各治療組降低（P＜0.05）；與同時間點I組相比，Q組降低（P＜0.05）；與同時間點Q組相比，H組、T組升高（P＜0.05）。
　　2.3肝功能、腎功能檢測
　　各組大鼠TP、ALB無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　與C組相比，M組SCr顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，Q組降低（P＜0.05），I組、H組、T組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）

19、。與C組相比，造模各組BUN均顯著升高（P＜0.01）；造模各組之間BUN無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相比，M組UA顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，Q組、T組降低（P＜0.05），I組、H組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　2.4體重、腎重及腎臟肥大指數(shù)（KI）比較
　　造模各組大鼠體重均顯著低于C組（P＜0.01）；造模各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。各組大鼠腎重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相

20、比，造模各組KI均顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，Q組、T組降低（P＜0.05），I組、H組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　2.5光鏡觀察結(jié)果
　　C組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；M組大鼠腎小球肥大，腎小囊呈裂隙狀，甚至出現(xiàn)球囊粘連，腎小球基底膜明顯增厚，系膜基質(zhì)增生，系膜區(qū)增寬；與M組相比，各治療組病理改變減輕；各治療組間比較，H組病理表現(xiàn)略重于其它三組。
　　2.6透射電鏡觀察結(jié)果
　　C組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清

21、晰；M組腎小球基底膜均質(zhì)增厚，足細胞足突融合，系膜基質(zhì)增生。與 M組比較，各治療組病理改變減輕；各治療組間比較，H組病理表現(xiàn)略重于其它三組。
　　與C組相比，M組腎小球基底膜顯著增厚（P＜0.01）；與M組相比，各治療組腎小球基底膜增厚均減輕（P＜0.01或0.05）；各治療組之間比較，H組增厚程度重于其它三組（P＜0.05）。
　　3化瘀通絡(luò)中藥及其不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎小球電荷屏障的干預(yù)作用
　　3.1 Rea

22、l-Time PCR檢測腎組織HSPG, HPA, PCX, GLEPP1 mRNA表達
　　各組大鼠腎組織HSPG mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　與C組相比，M組HPA mRNA表達顯著增多（P＜0.01）；與M組相比，I組、Q組、T組減少（P＜0.05），H組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。與C組相比，M組PCX mRNA表達減少（P＜0.05）；與M組相比， I組、Q組增多（P＜0.05），H組、T組無

23、統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　與C組相比，M組GLEPP1 mRNA表達減少（P＜0.05）；與M組相比，各治療組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　3.2免疫組織化學(xué)法檢測腎組織HSPG, HPA, PCX, GLEPP1蛋白表達
　　HSPG主要分布于腎小球基底膜和系膜基質(zhì)，各組大鼠腎組織HSPG核心蛋白表達量無明顯差異。
　　HPA在C組大鼠腎小球無明顯表達，在腎小管上皮細胞呈低表達；與C組相比，HP

24、A在M組大鼠腎小管上皮細胞表達明顯增加，并且在腎小球內(nèi)皮細胞表達；與M組相比，I組、Q組、T組HPA表達均減少，H組無明顯差異。
　　PCX, GLEPP1是足細胞的特異性蛋白。與 C組相比，M組 PCX, GLEPP1表達減少；與M組比較，I組、Q組PCX, GLEPP1表達增多，H組、T組無明顯差異。
　　3.3 Western Blot檢測腎組織HPA, PCX, GLEPP1蛋白表達
　　與C組相比，M組HPA

25、蛋白表達顯著增多（P＜0.01）；與M組相比，I組、Q組、T組減少（P＜0.05），H組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　與C組相比，M組PCX蛋白表達減少（P＜0.05）；與M組相比，I組、Q組增多（P＜0.05），H組、T組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。
　　與C組相比，M組GLEPP1蛋白表達減少（P＜0.05）；與M組相比，I組、Q組增多（P＜0.05），H組、T組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。3.4 ELISA檢

26、測各組大鼠尿PCX含量
　　與C組相比，M組大鼠尿PCX含量顯著增多（P＜0.01）；與M組相比，各治療組尿 PCX含量均減少（P＜0.05）；各治療組之間比較，I組、Q組、T組尿PCX含量少于H組（P＜0.05）。
　　3.5透射電鏡檢測腎小球基底膜陰離子位點
　　與C組相比，M組大鼠GBM上陰離子位點顯著減少（P＜0.01）；與M組相比，I組、Q組、T組AS增多（P＜0.05），H組無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）。<

27、br>　　4化瘀通絡(luò)中藥對高糖環(huán)境下足細胞電荷屏障相關(guān)蛋白的干預(yù)作用
　　4.1足細胞鑒定
　　分化成熟的足細胞呈樹枝狀，細胞核表達足細胞特異性蛋白WT-1。
　　4.2 MTT法篩選最佳藥物濃度
　　與同時間點NG組相比，HG組OD值均明顯降低（P＜0.01），MG組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與同時間點 HG組相比，24h后各給藥組OD值均升高（P＜0.05），但不同含藥血清濃度之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.0

28、5）；48h、72h后5%、10%、15%含藥血清組OD值高于2.5%含藥血清組（P＜0.05），且5%、10%、15%含藥血清組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。故以5%含藥血清濃度用于后續(xù)實驗。
　　4.3免疫細胞化學(xué)法檢測足細胞PCX、GLEPP1蛋白表達
　　免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示PCX、GLEPP1均表達于足細胞膜，NG組與MG組PCX、GLEPP1表達無明顯差異；與NG相比，HG組PCX、GLEPP1表達均明顯減少

29、；與HG組相比，ZG組PCX、GLEPP1表達均有所增加。
　　4.4 Real-Time PCR檢測足細胞PCX、GLEPP1 mRNA表達
　　NG組與MG組PCX mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）；與同時間點NG組相比，HG組PCX mRNA表達明顯減少（P＜0.01）；與同時間點HG組相比，ZG組PCX mRNA表達增加（P＜0.01）。
　　NG組與MG組GLEPP1 mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0

30、.05）；與同時間點NG組相比，HG組GLEPP1 mRNA表達明顯減少（P＜0.01）；與同時間點HG組相比，含藥血清干預(yù)24h，48h后GLEPP1 mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05），含藥血清干預(yù)72h后GLEPP1 mRNA表達增加（P＜0.05）。
　　4.5 Western Blot檢測足細胞PCX、GLEPP1蛋白表達
　　NG組與MG組PCX蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）；與同時間點NG組相比，H

31、G組PCX蛋白表達減少（P＜0.05）；與同時間點HG組相比，含藥血清干預(yù)24h后PCX蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05），含藥血清干預(yù)48h、72h后PCX蛋白表達增加（P＜0.05）。
　　NG組與MG組GLEPP1蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）；與同時間點NG組相比，HG組GLEPP1蛋白表達明顯減少（P＜0.01）；與同時間點HG組相比，ZG組GLEPP1蛋白表達增加（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　

32、1 以高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量 STZ復(fù)制的糖尿病大鼠模型制備成功后逐漸出現(xiàn)蛋白尿及DN腎臟病理學(xué)改變。且模型大鼠存在脂代謝紊亂，血管內(nèi)皮損傷，血小板異?；罨?，血液處于高凝狀態(tài)，符合中醫(yī)瘀血阻絡(luò)證改變。
　　2 化瘀通絡(luò)中藥及其不同配伍能改善DN大鼠瘀血阻絡(luò)狀態(tài)，并能減少DN大鼠尿蛋白，減輕腎臟病理損傷，延緩腎臟病進展，與厄貝沙坦作用相似。
　　3 化瘀通絡(luò)中藥及其不同配伍減少 DN大鼠尿蛋白的作用機制可能與其抑制腎臟HPA過