化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎組織整合素α3β1及Wnt-β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分：化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡(luò)相關(guān)血尿指標(biāo)的干預(yù)作用
　　目的：建立糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）大鼠模型，通過對大鼠糖脂代謝、蛋白尿排泄、血小板釋放及纖溶系統(tǒng)等指標(biāo)的檢測，來觀察化瘀通絡(luò)中藥不同配伍的干預(yù)作用，為臨床療效的提高及藥物的篩查提供依據(jù)。
　　方法：75只 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選10只為正常組（C組）給予普通飼料飼養(yǎng)，余大鼠予高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量

2、鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）腹腔注射建立 DN模型。成模大鼠隨機(jī)分為模型組（M組）15只，化瘀通絡(luò)組（Z組）15只，化瘀組（H組）14只，通絡(luò)組（T組）14只。大鼠造模成功后即予相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)，給藥量為丹參1.41 g/(kg?d)，川芎1.12 g/(kg?d)，地龍0.94 g/(kg?d)，水蛭0.56 g/(kg?d)，全蝎0.56 g/(kg?d)，Z組大鼠灌服丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎混懸液，H組大鼠灌

3、服丹參、川芎混懸液，T組大鼠灌服地龍、水蛭、全蝎混懸液，C組及 M組大鼠予以相應(yīng)體積的純凈水灌胃，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃20周。造模后各時間點（3天、4周、8周、12周、16周、20周）檢測大鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG），20周末檢測大鼠糖化血紅蛋白（Hemoglobin A1c，Hb A1c）、24h尿蛋白定量（urine total protein，UTP），麻醉大鼠，取血檢測血脂， Elisa

4、法檢測大鼠血漿β血小板球蛋白（Thromboglobulinβ，β-TG）、血小板因子4（Platelet Factor4， PF4）、纖溶酶原激活物（Tissue type Plasminogen Activator，t-PA）、纖溶酶原激活劑抑制因子1（Plasminogen Activator Inhibitor1，PAI-1）含量。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠一般情況實驗期間 C組大鼠無死亡，20周內(nèi) M、T組大鼠死亡

5、3只，Z組大鼠死亡2只，H組大鼠死亡4只，M組1只大鼠血糖緩解，Z、H、T組各2只大鼠血糖緩解，予以剔除。
　　2.不同時間點空腹血糖
　　與同時間點 C組比較，M、Z、H、T組大鼠 FBG明顯升高（P＜0.01）；與同時間點M組比較，Z、H、T組大鼠FBG水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.糖化血紅蛋白
　　與 C組比較，M、Z、H、T組大鼠 Hb A1c明顯升高（P＜0.01）；與M組比較，Z、H、T

6、組大鼠Hb A1c水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4.24小時尿蛋白定量
　　與 C組比較，M組大鼠24h UTP水平明顯升高（P＜0.01）；與 M組比較，Z、H、T組大鼠24h UTP水平明顯降低（P＜0.01）；與Z組比較，H、T組大鼠24h UTP水平明顯升高（P＜0.05）。
　　5.血脂
　　與 C組比較，M組大鼠膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycer

7、ide， TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipid cholesterol， HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipid cholesterol，LDL-C）和極低密度脂蛋白膽固醇（very low density lipid cholesterol，VLDL-C）水平明顯升高（P＜0.01）；與 M組比較，Z、H、T組 TC、HDL-C水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），TG、LDL-C

8、、VLDL-C水平顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）；與 Z組比較，H、T組TC、TG、HDL-C、VLDL-C水平無明顯差異（P＞0.05），H組 LDL-C水平明顯高于Z組（P＜0.05）。
　　6.血漿β-TG、PF4、t-PA、PAI-1含量
　　與 C組比較，M組大鼠血漿β-TG的含量明顯增多（P＜0.05）；與M組比較，Z、T組大鼠血漿中β-TG的含量明顯減少（P＜0.05或 P＜0.01）；與 Z組比較，

9、H組大鼠血漿β-TG水平明顯升高（P＜0.01），T組大鼠β-TG水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。各組大鼠血漿中 PF4的含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　與 C組比較，M組大鼠血漿t-PA含量明顯減少、PA I-1含量明顯增多（P＜0.05）；與M組比較，各干預(yù)組t-PA含量明顯增多（P＜0.05）， PAI-1含量 Z、T組明顯減少（P＜0.05），H組與 M組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與Z組比較，H、T組t-PA

10、含量無明顯差異（P＞0.05），PAI-1含量H組明顯增多（P＜0.05）。
　　第二部分：化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的干預(yù)作用
　　目的：驗證化瘀通絡(luò)中藥不同配伍是否能夠通過改善 DN大鼠脂代謝、血小板釋放及纖溶系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的變化，而產(chǎn)生對 DN腎損傷的保護(hù)作用。
　　方法：90只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選10只為 C組，造模方法同前。將成模大鼠隨機(jī)分為M組15只，厄貝沙坦組（I組）14只，Z組15

11、只，H組14只，T組14只。厄貝沙坦組給藥量為14.12 mg/(kg?d)，中藥干預(yù)同前。于注射 STZ后第3天，干預(yù)第4、8、12、16、20周末，計量各組大鼠體重、飲水量、飲食量、尿量。干預(yù)第20周末，采血檢測肝功能、腎功能，稱量腎重，留取部分腎皮質(zhì)用于光鏡染色及透射電鏡病理觀察。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠一般情況
　　實驗期間M、I、T組大鼠各死亡3只，Z組大鼠死亡2只，H組大鼠死亡4只，M組1只大鼠血糖緩解，

12、Z、H、T組各2只大鼠血糖緩解，予以剔除。
　　STZ注射后3天，各組大鼠之間體重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。在干預(yù)4周后，與同時間點 C組相比，M組大鼠體重明顯降低（P＜0.01）；與同時間點 M組相比，16周后 Z組大鼠體重明顯高于M組（P＜0.01），20周末H、T組大鼠體重明顯增加（P＜0.05）。
　　與同時間點 C組相比，M組大鼠攝食量明顯增多（P＜0.01）；與同時間點 M組比較，各干預(yù)組攝食量無統(tǒng)計學(xué)差異（P

13、＞0.05）；各干預(yù)組之間無顯著差異（P＞0.05）。
　　與同時間點 C組相比，M組大鼠飲水量、尿量均明顯增多（P＜0.01）；與同時間點 M組比較，Z組在16周后飲水量、尿量顯著減少（P＜0.01），而H、T組大鼠在20周末飲水量、尿量明顯低于M組（P＜0.05）；與同時間點 I組比較，16周末 Z組飲水量明顯低于I組（P＜0.05），20周末Z、H組大鼠飲水量、尿量均明顯減少（P＜0.05）。
　　2.腎臟指數(shù)（kid

14、ney index，KI）
　　與 C組比較，M組 KI顯著升高（P＜0.01）；與 M組比較，Z、T組顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　3.肝功能、腎功能
　　各組之間比較，血清總蛋白（total protein， TP）、血清白蛋白（albumin，ALB）無明顯差異（P＞0.05）。與C組比較，M組大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，

15、BUN）、尿酸（uric acid，UA）均明顯升高（P＜0.01）；與 M組相比，各干預(yù)組 Scr無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），Z組BUN顯著低于M組（P＜0.05），I、Z、T組 UA明顯低于M組（P＜0.01）；與 I組比較，Z組 BUN明顯降低（P＜0.01）；H、T組BUN高于Z組（P＜0.05），H組UA高于Z組（P＜0.05）。
　　4.24小時尿蛋白定量
　　STZ注射后3天檢測各組24h UTP無顯著差異（

16、P＞0.05）。M組大鼠24h UTP均高于同時間點 C組（P＜0.01）；與同時間點 M組比較，各干預(yù)組24h UTP均有所降低（P＜0.01或P＜0.05）；與同時間點 I組比較，16周后 Z組大鼠24h UTP明顯減少（P＜0.01）；Z組在16、20周末24h UTP均明顯低于H組（P＜0.05），Z組僅在20周24h UTP低于T組（P＜0.05）。
　　5.內(nèi)生肌酐清除率（creatinine clearance ra

17、te，Ccr）
　　與 C組比較，M組大鼠 Ccr明顯升高（P＜0.01）；與 M組比較，各干預(yù)組Ccr均明顯下降（P＜0.01或P＜0.05）。
　　6.光鏡觀察
　　C組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常；M組大鼠腎小球肥大，囊腔狹窄，部分節(jié)段出現(xiàn)球囊黏連，系膜基質(zhì)增多，基底膜增厚，腎小管細(xì)胞腫脹，腎間質(zhì)出現(xiàn)部分纖維化。與 M組比較，各干預(yù)組光鏡觀察可見不同程度的減輕。計算腎小球體積（GV）并比較，M組大鼠 GV明顯增大（P＜0.0

18、1）；與 M組比較，各干預(yù)組 GV均明顯減小（P＜0.01或 P＜0.05）；與I組比較，Z、T組GV顯著減小（P＜0.01或P＜0.05）。
　　7.電鏡觀察
　　C組大鼠超微結(jié)構(gòu)正常；M組可見腎小球基底膜均質(zhì)增厚，足突融合嚴(yán)重，系膜基質(zhì)增生。與M組比較，各干預(yù)組病理改變減輕，表現(xiàn)為基底膜增厚減輕，足突節(jié)段融合。
　　第三部分：化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對糖尿病腎病大鼠腎組織整合素α3β1表達(dá)及足細(xì)胞密度的影響
　　

19、目的：本部分內(nèi)容重在研究DN大鼠腎組織中整合素α3β1的表達(dá)變化及足細(xì)胞密度的關(guān)系，及化瘀通絡(luò)中藥不同配伍降低蛋白尿的作用靶點是否與此相關(guān)。
　　方法：大鼠造模及分組同前，干預(yù)方法同前。干預(yù)第20周末，麻醉大鼠，留取部分腎皮質(zhì)采用 Real-time PCR法及免疫組化法檢測ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA及蛋白的表達(dá)。采用 WT-1標(biāo)記足細(xì)胞核，計數(shù)足細(xì)胞數(shù)量，計算足細(xì)胞密度。
　　結(jié)果：
　　1.Real-

20、time PCR檢測腎組織ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA表達(dá)
　　與 C組相比，M組 ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA的表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；與M組相比，I組、Z組 ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA的表達(dá)增加（P＜0.01或P＜0.05），T組 ITGA3，WT1 mRNA的表達(dá)增加（P＜0.05）；與 I組相比，H組 ITGA3 mRNA表達(dá)減少（P＜0.05），Z組 ITGB1 mRNA表達(dá)增

21、加（P＜0.05）；與 Z組相比，H組 ITGA3， ITGB1，WT1 mRNA的表達(dá)均明顯減少（P＜0.05），T組ITGB1 mRNA表達(dá)亦減少（P＜0.05）。
　　2.免疫組織化學(xué)法檢測腎組織ITGA3，ITGB1，WT1蛋白的表達(dá)
　　ITGA3，ITGB1主要分布于腎小球基底膜和系膜基質(zhì)，少量分布于足細(xì)胞胞質(zhì)中，二者在C組大鼠腎小球高表達(dá)；與C組相比，ITGA3， ITGB1在 M組大鼠腎小球表達(dá)明顯減少；與

22、M組比較，I、Z、T組二者表達(dá)增多，H組無明顯差異。WT1是足細(xì)胞的特異性蛋白，表達(dá)在腎小球中且位于足細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)；與 C組相比，M組 WT1表達(dá)減少；與M組比較，I、Z、T組WT1表達(dá)增多，H組無明顯差異。
　　3.各組大鼠腎小球內(nèi)足細(xì)胞密度的檢測
　　與C組相比，M組大鼠足細(xì)胞密度顯著減少（P＜0.01）；與M組相比，I、Z、T組大鼠足細(xì)胞密度增加（P＜0.01或 P＜0.05）；與 I組比較，H組密度減少（P＜0.0

23、5）；與Z組相比，H組足細(xì)胞密度減少（P＜0.05），T組無顯著差異（P＞0.05）。
　　第四部分：Wnt/β-catenin通路在糖尿病腎病大鼠的表達(dá)及化瘀通絡(luò)中藥不同配伍的干預(yù)作用
　　目的：本部分研究制備 DN大鼠模型，意在探索該大鼠模型腎臟是否存在 Wnt/β-catenin通路的異常表達(dá)，以及化瘀通絡(luò)中藥減輕足細(xì)胞損傷、改善腎臟纖維化、減少蛋白尿的作用靶點是否與 Wnt/β-catenin通路有關(guān)。
　　方

24、法：大鼠造模及分組同前，干預(yù)方法同前。干預(yù)第20周末，麻醉大鼠，留取部分腎皮質(zhì)采用 Real-time PCR法檢測 ILK， Wnt4， GSK3β，β-catenin，E-cadherin mRNA表達(dá)，免疫組化法檢測 Wnt4，p-GSK3β(S9)，β-catenin，E-cadherin蛋白表達(dá)，Western-blot法檢測ILK， Wnt4，p-GSK3β(S9)，GSK3β，β-catenin，E-cadherin蛋白的

25、表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.Real-time PCR檢測腎組織 ILK，Wnt4，GSK3β，β-catenin，E-cadherin mRNA表達(dá)
　　與C組相比，M組大鼠ILK，Wnt4，β-catenin mRNA的表達(dá)明顯升高，E-cadherin mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01或 P＜0.05）；與 M組相比，各干預(yù)組 ILK，Wnt4，β-catenin mRNA的表達(dá)下降（P＜0.01或 P＜0.0

26、5）， I、Z、T組 E-cadherin mRNA表達(dá)上升（P＜0.01或 P＜0.05）；與I組相比，H組β-catenin mRNA表達(dá)增多（P＜0.05），Z組E-cadherin mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）；與 Z組相比， H組β-catenin mRNA的表達(dá)明顯升高， E-cadherin mRNA表達(dá)減少（P＜0.05）。GSK3βmRNA表達(dá)各組大鼠腎組織均無顯著差異（P＞0.05）。
　　2.免疫組織化學(xué)

27、法檢測腎組織 Wnt4， p-GSK3β，β-catenin， E-cadherin蛋白的表達(dá)
　　C組大鼠Wnt4蛋白僅微弱表達(dá)于部分腎小管上皮細(xì)胞中，p-GSK3β蛋白在腎小球、腎小管均有少量表達(dá)，β-catenin蛋白在部分腎小球、腎小管上皮細(xì)胞及遠(yuǎn)端小管有少量表達(dá)；與 C組相比，Wnt4、p-GSK3β、β-catenin在 M組大鼠腎小球及腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)明顯增多；與 M組比較，各干預(yù)組表達(dá)均有不同程度的下降。C組大鼠

28、 E-cadherin蛋白主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞及部分腎小球系膜區(qū)；與 C組相比，M組 E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少；與 M組比較，各干預(yù)組 E-cadherin蛋白有不同程度的表達(dá)增多。
　　3.Western-blot檢測腎組織 ILK， Wnt4， p-GSK3β， GSK3β，β-catenin，E-cadherin蛋白的表達(dá)
　　與C組相比，M組大鼠 ILK，Wnt4，p-GSK3β，β-catenin蛋

29、白的表達(dá)明顯升高，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）；與M組相比，各干預(yù)組 ILK，Wnt4，β-catenin蛋白的表達(dá)下降（P＜0.01或P＜0.05），I、Z、H組 p-GSK3β蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.01或 P＜0.05），I、Z、T組 E-cadherin蛋白的表達(dá)上升（P＜0.01或 P＜0.05）；與 Z組相比，H組 E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；GSK3β蛋白

30、表達(dá)各組大鼠腎組織無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.模型大鼠存在明顯的糖脂代謝紊亂、血小板釋放功能增強(qiáng)及纖溶系統(tǒng)活性低下的病理表現(xiàn)，出現(xiàn)明顯蛋白尿及腎臟病理損傷，表明 DN大鼠模型成功復(fù)制。
　　2.化瘀通絡(luò)中藥、化瘀中藥、通絡(luò)中藥均可不同程度地改善 DN大鼠脂代謝紊亂、抑制異常血小板活化、改善血小板釋放及纖溶功能低下的表現(xiàn)，減少蛋白尿排泄，減輕腎小球高灌注高濾過狀態(tài)，減輕腎臟損傷，具有確切的腎臟保護(hù)作

31、用。
　　3.化瘀通絡(luò)中藥、通絡(luò)中藥可上調(diào)整合素α3β1的表達(dá)水平，減少足細(xì)胞脫落，減輕足細(xì)胞損傷，維持腎小球濾過功能的正常，這可能是二者減少 DN大鼠蛋白尿排泄的作用機(jī)制之一；化瘀中藥單獨應(yīng)用對足細(xì)胞脫落無明顯影響。
　　4.化瘀通絡(luò)中藥可抑制 ILK的部分活化，對 DN大鼠腎臟 Wnt/β-catenin通路的高表達(dá)具有一定的抑制作用，這可能是該藥物保護(hù)足細(xì)胞、減少蛋白尿排泄的主要途徑之一。
　　5.化瘀通絡(luò)中藥聯(lián)