活性氧族在CHO細胞補料批次培養(yǎng)中的作用、機制及調(diào)控研究.pdf

1、單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)藥物因具有靶向性高、副作用小、療效持久等優(yōu)點，目前已成為腫瘤治療的重要手段之一。截至2016年2月全球已有21個抗腫瘤單克隆抗體藥物獲批上市，用于多種實體瘤、血液腫瘤等的治療。如何進一步提高抗體藥物的產(chǎn)量，以滿足日益擴大的市場需求已成為亟待解決的技術難題。中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）是目前抗體藥物產(chǎn)業(yè)中應用最廣泛、培養(yǎng)工藝最成熟的真核

2、宿主表達細胞。在CHO細胞工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡是在培養(yǎng)中后期導致活細胞密度下降，進而影響單抗藥物表達量的主要因素之一。細胞有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性氧族(reactive oxygen species，ROS)與細胞凋亡密切相關，本課題旨在探究ROS在CHO細胞補料批次培養(yǎng)中的作用、機制和調(diào)控方式，從而有效提高單克隆抗體藥物的表達量。
　　本課題利用流式細胞術檢測批次培養(yǎng)中CHO細胞內(nèi)ROS水平，結果顯示隨著細胞密度的增長，R

3、OS水平迅速升高;當細胞生長達到最高密度后細胞活率、活細胞密度均發(fā)生驟降。在CHO細胞批次培養(yǎng)中分別加入50、100、200μM過氧化氫(H2O2)，發(fā)現(xiàn)各組細胞均受到不同程度的生長抑制。這提示細胞內(nèi)ROS積累與生長衰退有一定關系。
　　本課題從兩個方面對CHO細胞培養(yǎng)中ROS水平進行調(diào)控。首先是外源途徑，即在培養(yǎng)基中額外添加還原性物質(zhì)硫辛酸。在批次培養(yǎng)中分別向培養(yǎng)基中添加0、25、50、100與200μM硫辛酸，結果顯示100μ

4、M組活細胞密度積分(IVCD)最高，為54.65×106 cells/mL days，因此將補料批次培養(yǎng)中硫辛酸的添加濃度設為100μM。應用熒光探針DCFH-DA檢測對照組與硫辛酸組細胞內(nèi)ROS水平，結果顯示在培養(yǎng)第五至八天硫辛酸組細胞的ROS水平均顯著低于對照組;使用臺盼藍拒染法描記CHO細胞生長、活率圖，結果顯示在培養(yǎng)中后期，與對照組相比100μM硫辛酸組的活細胞密度、細胞活率、IVCD均顯著增高;同時利用高效液相色譜法檢測培養(yǎng)終

5、末期對照組細胞上清抗體濃度為0.88 g/L，硫辛酸組濃度為1.04 g/L，表達量提高約18.0％，具有統(tǒng)計學差異(p0.05);在抗體表征方面，還原與非還原性SDS-PAGE實驗結果顯示，硫辛酸組細胞表達的單克隆抗體分子在二硫鍵修飾上與對照組一致;通過液質(zhì)聯(lián)用技術檢測抗體N-糖基化修飾，結果表明兩組的主要糖型種類及所占比例無顯著差異;同時我們通過Annexin V/PI法檢測兩組細胞凋亡率，結果顯示在補料批次培養(yǎng)第八至十天硫辛酸組細

6、胞凋亡率均顯著低于對照組細胞，且western blot實驗證實，培養(yǎng)后期對照組凋亡發(fā)生相關蛋白Caspase-7剪切體表達水平高于硫辛酸組細胞。以上實驗結果表明，硫辛酸顯著降低了CHO胞內(nèi)ROS水平，抑制補料批次培養(yǎng)中后期細胞凋亡，提高了活細胞密度積分及單克隆抗體表達量。
　　第二方面是通過內(nèi)源途徑對ROS水平進行調(diào)控。蘋果酸酶-1(malic enzyme1，ME-1)主要作用是催化胞漿內(nèi)蘋果酸氧化脫羧，此過程同時伴隨NADP

7、+的還原反應。本課題利用基因工程技術構建了pcDNA3.0-ME-1真核表達載體，細胞轉染后通過抗生素篩選得到穩(wěn)定表達ME-1基因的CHO細胞庫（CHO-ME-1 pool）。在CHO-ME-1細胞與對照組細胞的補料批次培養(yǎng)中，檢測顯示在對數(shù)生長期CHO-ME-1組細胞內(nèi)ROS水平顯著低于對照組。細胞生長活率方面，從培養(yǎng)第八天直至培養(yǎng)終末期，CHO-ME-1組的活細胞密度、細胞活率均高于對照組，IVCD值提高了約33.0％，抗體表達量提

8、高了約16.9％，差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)?？贵w藥物表征研究結果顯示，CHO-ME-1細胞表達的抗體在分子量、二硫鍵修飾、N-糖基化修飾等方面與對照組沒有顯著差異，符合預期質(zhì)量標準。同時在細胞培養(yǎng)中后期，CHO-ME-1組細胞凋亡率、Caspase-7活化剪切體的表達水平均顯著低于對照組(p0.01)。
　　本課題發(fā)現(xiàn)，ROS的過量累積會對CHO細胞生長產(chǎn)生抑制作用，通過建立內(nèi)源、外源兩種途徑可以有效降低細胞內(nèi)ROS水平，