活性氧在休克腸淋巴液介導急性肺損傷中的作用與機制.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種致病因素造成的肺實質(zhì)細胞出現(xiàn)嚴重炎癥反應(yīng)，導致肺通透性增高、發(fā)生急性肺水腫的結(jié)果。由于失血性休克引起的微循環(huán)障礙以及肺的血流動力學特點，使得失血性休克患者最易發(fā)生ALI，可迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），嚴重危及患者生命。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，減少腸淋巴液回流，可減輕肺損傷，在降低肺組織氧化應(yīng)激的

2、同時，降低了肺組織Toll樣受體2(toll-like receptor2，TLR2)、TLR4的表達以及高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box1，HMGB1)的表達。研究表明，失血性休克后，活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量產(chǎn)生與釋放，通過激發(fā)組織機體的炎性反應(yīng)、介導細胞凋亡及增加血管通透性等方面導致ALI。但失血性休克后腸淋巴液(post-hemorrhagic shoc

3、k mesenteric lymph，PHSML)介導ALI過程中是否有ROS的參與，尚不清楚。減少PHSML回流是否可降低肺組織ROS的產(chǎn)生與釋放，PHSML介導肺組織ROS的產(chǎn)生與釋放是否受TLR2、TRL4、HMGB1的影響（和/或影響TLR2、TLR4、HMGB1的表達）?有待研究。
　　因此，本文在前期研究基礎(chǔ)上，采用失血性休克小鼠模型，觀察PHSML引流對失血性休克小鼠肺組織結(jié)構(gòu)以及ROS含量變化的影響，觀察靜脈回輸P

4、HSML是否引起小鼠（野生型、TLR2-/-、TLR4-/-）肺組織結(jié)構(gòu)損傷、ROS產(chǎn)生與釋放及TLR2、TLR4分子表達，并進一步從細胞層面觀察ROS抑制劑(NAC)、TLR2及TLR4封閉性抗體處理小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)后，PHSML對PMVECs產(chǎn)生ROS的影響，從而驗證PHSML是肺組織ROS產(chǎn)生增多的作用因素之一，該作用是通過TL

5、R2、TLR4、HMGB1介導的。
　　首先，將野生型(WT)C57BL/6J小鼠18只隨機均分為假手術(shù)組(Sham)、失血性休克組(Shock)、休克+引流組(Shock+drainage)組;常規(guī)方法建立失血性休克模型，觀察PHSML對失血性休克小鼠肺組織形態(tài)與ROS含量的作用。結(jié)果顯示，Sham組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常;Shock組小鼠肺組織嚴重破壞，間隔增寬，多見炎性滲出及出血，肺泡腔大量融合;Shock+drainage

6、組小鼠肺組織損傷較輕。同時可見，失血性休克引起了小鼠肺組織ROS顯著增高，PHSML引流顯著降低了Shock組小鼠肺組織ROS含量。
　　隨后，應(yīng)用TLR2-/-、TLR4-/-小鼠各12只，均分為Sham、Shock組，常規(guī)方法建立失血性休克模型，觀察TLR2、TLR4基因敲除對失血性休克小鼠肺組織形態(tài)與ROS含量的作用。結(jié)果顯示，TLR2-/-、TLR4-/-的Shock組小鼠肺組織肺間隔炎性物質(zhì)滲出，間隔增寬，肺泡部分融合，

7、但程度較WT小鼠低，且肺組織ROS含量均顯著低于WTShock組小鼠。
　　然后，應(yīng)用50只WT小鼠，引流正常淋巴液(normal mesenteric lymph，NML)和PHSML（與前述相同的失血性休克模型），分別靜脈輸入至WT、TLR2-/-、TLR4-/-小鼠，每組6只，觀察靜脈輸入PHSML對各型小鼠肺組織形態(tài)、ROS含量以及TLR2、TLR4mRNA表達的影響。結(jié)果顯示，靜脈輸入NML對WT、TLR2-/-、TLR

8、4-/-小鼠肺組織結(jié)構(gòu)無明顯影響，靜脈輸入PHSML引起了WT正常小鼠出現(xiàn)了比較嚴重的肺組織損傷，而靜脈輸入PHSML對TLR2-/-、TLR4-/-小鼠肺組織損傷的程度較輕。同時可見，靜脈輸入PHSML引起了WT正常小鼠肺組織ROS含量以及TLR2、TLR4的mRNA表達顯著高于輸入NML組;靜脈輸入PHSML至TLR2-/-、TLR4-/-小鼠的肺組織ROS含量顯著低于WT小鼠，高于輸入NML的同型小鼠;靜脈輸入PHSML至TLR4

9、-/-小鼠肺組織的TLR2mRNA表達顯著高于輸入NML的TLR4-/-小鼠以及輸入PHSML的WT小鼠;同樣，靜脈輸入PHSML至TLR2-/-小鼠肺組織的TLR4mRNA表達顯著高于輸入NML的TLR2-/-小鼠以及輸入PHSML的WT小鼠。
　　為了進一步驗證ROS在PHSML介導ALI中的作用及其與TLR2、TLR4的關(guān)系，本文以小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(PMVECs)作為研究對象，觀察了ROS特異性抑制劑NAC、TLR2和T

10、LR4封閉性抗體對PHSML損傷PMVECs以及促進PMVECs產(chǎn)生ROS的作用。結(jié)果顯示，PHSML引起了PMVECs損傷、ROS產(chǎn)生增多，NAC、TLR2和TLR4封閉性抗體均減輕了PHSML導致的PMVECs結(jié)構(gòu)損傷，抑制了PHSML增加PMVECs產(chǎn)生ROS的作用。
　　此外，針對HMGB1在PHSML介導ALI中的作用，本文進一步觀察了正常小鼠腹腔注射HMGB1抑制劑甘草酸(Glycyrrhizic acid，GL)處理

11、后，靜脈輸入PHSML后肺組織形態(tài)與ROS含量的變化。結(jié)果顯示，GL預(yù)先處理顯著降低了靜脈輸入PHSML損傷正常小鼠肺組織、增加ROS產(chǎn)生的作用。說明HMGB1參與了PHSML介導ALI的ROS機制。
　　上述研究表明，PHSML引起肺組織ROS的過度產(chǎn)生是失血性休克ALI的重要機制之一;PHSML介導肺組織ROS過度產(chǎn)生與釋放的機制與TLR2、TLR4、HMGB1有關(guān)。以PHSML、ROS為干預(yù)靶點，對于防治重癥休克導致的ALI