IL-21在心肌缺血再灌注損傷中的作用和機制研究.pdf

1、第一部分 IL-21在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的表達規(guī)律及作用
　　目的：免疫系統(tǒng)激活在心肌缺血再灌注損傷（MIRI）中發(fā)揮的重要作用已得到廣泛證實。IL-21是一種多效性細胞因子，其在MIRI中的作用尚不明確。本部分實驗旨在研究IL-21及其受體在小鼠MIRI中的表達規(guī)律，并探討IL-21對MIRI的作用。
　　方法：通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建小鼠MIRI模型，通過real-time PCR和western blot檢測

2、缺血再灌注后不同時間點（30 min、1 h、6 h、12 h、24 h）心肌組織IL-21及受體特異鏈IL-21R的表達水平。為明確IL-21在MIRI中的作用，在再灌注前給予IL-21中和性抗體或重組小鼠IL-21對MIRI模型進行預處理以阻斷或增強IL-21的效應，于再灌注1天時檢測MIRI相關(guān)各項指標的改變，包括Even’s blue/TTC雙染色法測定心肌梗死面積、血清肌鈣蛋白（TnT）檢測心肌損傷以及心臟超聲測定左室射血分數(shù)

3、（EF）和左室縮短分數(shù)（FS）評價心功能。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組相比，再灌注后30 min小鼠心肌組織中IL-21 mRNA和蛋白表達均開始升高，并持續(xù)至再灌注后24 h。IL-21受體特異鏈IL-21RmRNA和蛋白表達均在再灌注后12h開始升高，并持續(xù)至24 h。與同型對照抗體組相比，中和IL-21的作用能夠縮小梗死面積、降低血清 TnT水平及改善心功能。與之相反，外源性給予重組IL-21則明顯增加心肌梗死面積、升高血清cTn

4、T水平，并使心功能損傷加重。
　　結(jié)論：IL-21及其受體在小鼠MIRI后早期表達上調(diào)；中和內(nèi)源性IL-21可減輕MIRI，而外源性IL-21干預則會加重MIRI。
　　第二部分 IL-21通過募集中性粒細胞浸潤參與心肌缺血再灌注損傷
　　目的：以往研究表明，MIRI后大量中性粒細胞浸潤及其介導的炎癥反應是加重MIRI的重要機制之一。本部分實驗旨在探討IL-21是否影響MIRI后中性粒細胞浸潤，及其相關(guān)機制。
　

5、　方法：8-12周齡雄性C57B/L6小鼠隨機分為假手術(shù)組、MIRI對照組、MIRI外源性IL-21干預組，應用流式細胞術(shù)定量檢測再灌注3 h后局部心肌組織中性粒浸潤的數(shù)目；Real-time PCR檢測心肌組織ELR+CXC趨化因子KC、MIP-2和LIX的表達。體外分離培養(yǎng) C57B/L6小鼠乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞，給予 IL-21刺激后通過real-time PCR檢測KC和MIP-2 mRNA表達，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上

6、清中KC和MIP-2的濃度。體外分離成年C57B/L6小鼠骨髓中性粒細胞，與有或無IL-21刺激的心肌細胞或心臟成纖維細胞培養(yǎng)上清分別置于transwell上、下小室中，檢測中性粒細胞遷移活性。
　　結(jié)果：流式細胞術(shù)定量分析顯示，與假手術(shù)組相比，MIRI組小鼠心肌組織中性粒細胞浸潤數(shù)目增加，而給予外源性IL-21干預進一步增加了心肌組織中性粒細胞浸潤程度。給予外源性IL-21上調(diào)了再灌注后30 min和3 h心肌組織KC、MIP-

7、2 mRNA表達，而不影響LIX表達。體外實驗中，給予IL-21刺激1 h后，心肌細胞、心臟成纖維細胞KC和MIP-2 mRNA表達均較對照組明顯升高；給予IL-21刺激24h后，兩種細胞培養(yǎng)上清中KC、MIP-2濃度亦明顯升高。中性粒細胞趨化實驗結(jié)果顯示，IL-21刺激心肌細胞、心臟成纖維細胞后的條件培養(yǎng)上清能夠促進中性粒細胞遷移。
　　結(jié)論：IL-21可能通過上調(diào)心肌細胞和心臟成纖維細胞中趨化因子KC和MIP-2的表達，促進中

8、性粒細胞遷移，進而介導MIRI后心肌組織局部中性粒細胞浸潤。
　　第三部分 IL-21促進心肌缺血再灌注損傷和中性粒細胞浸潤的分子機制
　　目的：以往研究表明，JAK-STAT（主要是STAT1和STAT3）、PI3K/Akt、ERK、p38 MAPK和NF--κB等信號通路參與了IL-21在不同細胞類型的不同生物學效應；同時，上述信號通路也在MIRI的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本部分實驗通過在組織學和細胞學水平分別探討IL-21

9、對上述信號通路激活的效應，以期闡明IL-21誘導心肌細胞、心臟成纖維細胞趨化因子表達，促進中性粒細胞浸潤并介導心肌損傷的分子機制。
　　方法：8-12周齡雄性C57B/L6小鼠構(gòu)建MIRI模型，取假手術(shù)組和MIRI再灌注不同時間點（10 min、30 min、60 min、120 min）心肌組織，western blot檢測ERK、p38 MAPK、Akt、NF-κB p65、STAT1和STAT3通路激活的時間規(guī)律。構(gòu)建小鼠M

10、IRI模型，分為對照組和IL-21干預組，分別于再灌注后10min、30min通過western blot檢測IL-21對各信號通路關(guān)鍵分子磷酸化程度的改變。離體分離培養(yǎng)小鼠乳鼠心肌細胞、心臟成纖維細胞，western blot檢測IL-21刺激不同時間點（10 min、30 min、60 min、120 min）各信號通路磷酸化改變。為進一步明確IL-21處理后發(fā)生激活的信號通路是否為調(diào)控趨化因子表達的信號機制，于IL-21刺激兩種細

11、胞前分別給予相應信號通路阻滯劑預處理，real-time PCR和ELISA分別檢測KC、MIP-2 mRNA表達和分泌的改變。
　　結(jié)果：在小鼠MIRI模型中，再灌注10 min時ERK、p38 MAPK和NF-κB p65即開始激活，而Akt、STAT1和STAT3在再灌注30 min后開始激活。進一步在再灌注10 min、30 min兩個時間點分別檢測在體IL-21干預對各信號通路激活的影響。結(jié)果顯示，再灌注10 min時，

12、IL-21增強了p38 MAPK的激活效應；再灌注30 min時，IL-21可同時激活p38 MAPK和NF--κB信號通路。然而，IL-21對其他信號通路關(guān)鍵分子并無明顯激活效應。細胞水平上，心肌細胞在IL-21刺激10-30 min時表現(xiàn)為Akt激活，NF-κB p65是其下游信號分子，于30 min開始激活并持續(xù)至2 h。心臟成纖維細胞p38 MAPK通路在IL-21刺激30 min后開始激活，而NF-κB p65于1 h后開始激

13、活。此外，IL-21處理心肌細胞、成纖維細胞后ERK、STAT1或STAT3通路均未見激活。在IL-21刺激前，心肌細胞給予PI3K/Akt阻滯劑或NF-κB阻滯劑預處理可顯著抑制KC、MIP-2mRNA表達，其分泌被部分抑制。相似地，心臟成纖維細胞給予p38 MAPK阻滯劑或NF-κB阻滯劑預處理同樣可顯著抑制KC、MIP-2 mRNA表達和分泌。
　　結(jié)論：心肌細胞Akt/NF-κB信號通路和心臟成纖維細胞p38 MAPK/N