吡非尼酮抑制眼眶成纖維細(xì)胞應(yīng)力纖維及粘著斑重構(gòu)作用和細(xì)胞功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：眼外肌來(lái)源成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化
　　目的：研究TAO眼外肌來(lái)源的成纖維細(xì)胞，在TGF-β1作用下的細(xì)胞生長(zhǎng)分化狀態(tài)。
　　方法：通過(guò)組織塊培養(yǎng)法收集TAO眼外肌來(lái)源的成纖維細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)及免疫標(biāo)記物鑒定為成纖維細(xì)胞；通過(guò)MTT法觀察成纖維細(xì)胞在不同濃度TGF-β1（1μg/L、5μg/L、10μg/L）誘導(dǎo)后的增殖效應(yīng)；通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA；通過(guò)Western檢測(cè)不同濃

2、度（1μg/L、5μg/L、10μg/L）和時(shí)間（24h、48h、72h）效應(yīng)下，TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA水平。
　　結(jié)果：⑴原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞漿豐滿，核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，細(xì)胞融合后呈放射狀、漩渦狀排列緊密；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：vimentin陽(yáng)性表達(dá)，Desmin、Kerati、S-100、第Ⅷ因子呈陰性反應(yīng)，可以鑒定TAO組和正常對(duì)照組眼外肌標(biāo)本培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。⑵MTT法檢測(cè)TG

3、F-β1誘導(dǎo)72h后的成纖維細(xì)胞增殖率具有劑量效應(yīng)，10μg/L TGF-β1組細(xì)胞增殖率最高，為107.35％（P﹤0.05）；TAO組和正常對(duì)照組的成纖維細(xì)胞MTT光密度值比較，差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。⑶10μg/L TGF-β1處理24h，成纖維細(xì)胞胞漿豐滿，體型增大，細(xì)胞足突增多；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示胞漿內(nèi)大量α-SMA表達(dá)，強(qiáng)陽(yáng)性染色；陰性處理組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)α-SMA量少。⑷Western-blot檢測(cè)TGF-β1

4、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA蛋白具有劑量和時(shí)間效應(yīng)，10μg/L TGF-β1處理48h具有最大表達(dá)量（P﹤0.05）；TAO組和正常對(duì)照組的成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)量相互比較，差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　結(jié)論：利用組織塊貼壁法培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特征明顯，可用于甲狀腺相關(guān)眼病的體外研究對(duì)象。TGF-β1具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和向肌纖維母細(xì)胞分化作用，其誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)水平增高在一定范圍內(nèi)具有濃

5、度和時(shí)間依賴性。
　　第二部分：吡非尼酮抑制成纖維細(xì)胞增殖、分化、遷移及收縮功能的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究吡非尼酮對(duì)TAO眼外肌成纖維細(xì)胞的增殖、分化、遷移和收縮膠原作用的影響。
　　方法：在不同濃度TGF-β1、吡非尼酮、地塞米松作用下，通過(guò)MTT法檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖作用，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活狀態(tài)。在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮、1000nM地塞米松作用下，利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移作用，免

6、疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)α-SMA、fibronectin的作用，以及凝膠收縮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞收縮膠原的作用。
　　結(jié)果：⑴MTT法檢測(cè)吡非尼酮抑制成纖維細(xì)胞增殖率具有劑量效應(yīng)，0.5mg/ml、1.0mg/ml吡非尼酮的72h細(xì)胞增殖率，分別為-24.82%、-41.84%，二者M(jìn)TT值與空白對(duì)照組比較，P﹤0.05；吡非尼酮較地塞米松具有更強(qiáng)的抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用（P﹤0.05）。⑵臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察不同濃度吡非尼酮

7、作用72h后，成纖維細(xì)胞活性良好，未見(jiàn)明顯細(xì)胞毒性作用。⑶細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，TGF-β1具有促進(jìn)細(xì)胞遷移和融合效應(yīng)；吡非尼酮抑制細(xì)胞遷移作用明顯（P﹤0.05）。⑷免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，吡非尼酮作用72h后成纖維細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯α-SMA表達(dá)；地塞米松組成纖維細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)α-SMA?？瞻讓?duì)照組、TGF-β1組、地塞米松組72h后均可見(jiàn)fibronectin在成纖維細(xì)胞內(nèi)外高表達(dá)，并聚合成互相連接的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；吡非尼酮組、吡非尼酮聯(lián)合TG

8、F-β1組72h后fibronectin表達(dá)被抑制。⑸凝膠收縮實(shí)驗(yàn)顯示，連續(xù)觀察6天后，TGF-β1組的收縮指數(shù)為59.38%，與空白對(duì)照組比較，顯示強(qiáng)大的促進(jìn)成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的膠原收縮作用（P﹤0.05）；吡非尼酮組、吡非尼酮聯(lián)合TGF-β1組的收縮指數(shù)分別為6.70%和8.02%，具有明顯抑制成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的膠原收縮作用（P﹤0.05）；地塞米松組收縮指數(shù)25.48%，與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　結(jié)論：吡

9、非尼酮可抑制體外培養(yǎng)眼眶成纖維細(xì)胞的增殖和向肌纖維母細(xì)胞表型分化；抑制成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞的遷移和膠原收縮作用；并且對(duì)fibronectin的表達(dá)也有明顯的下調(diào)作用。吡非尼酮較地塞米松具有更強(qiáng)的抑制TGF-β1介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖、分化、遷移和膠原收縮作用。
　　第三部分:吡非尼酮抑制眼眶成纖維細(xì)胞應(yīng)力纖維重構(gòu)及粘著斑成熟作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究吡非尼酮對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下的TAO眼外肌成纖維細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維

10、構(gòu)建和粘著斑成熟分化的作用，以及相關(guān)信號(hào)通路的影響。
　　方法：在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮作用下，利用免疫熒光技術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維、粘著斑蛋白和Ⅰ型膠原形態(tài)及細(xì)胞定位，Western-blot檢測(cè)Akt、Phospho-Akt、FAK、Phospho-FAK蛋白的表達(dá)，以及通過(guò)MaxGelTM檢測(cè)成纖維細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中的粘附作用。
　　結(jié)果：⑴共聚焦顯微鏡下觀察，吡非尼

11、酮抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞分化，降低α-SMA陽(yáng)性應(yīng)力纖維構(gòu)建；抑制paxillin、tensin蛋白表達(dá)，抑制粘著斑分化成熟，相應(yīng)粘著斑面積和數(shù)量較空白對(duì)照組減小（P﹤0.05）。⑵Western Blot結(jié)果顯示，吡非尼酮單獨(dú)作用或聯(lián)合TGF-β1均可抑制Akt與磷酸化Akt，F(xiàn)AK與磷酸化FAK表達(dá)（P﹤0.05）；吡非尼酮對(duì)Akt磷酸化抑制作用更明顯（P﹤0.05）。⑶細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)表明，吡非尼酮作用24h后