甲狀腺相關(guān)性眼病眼眶成纖維細(xì)胞亞型與功能研究.pdf

1、研究目的：甲狀腺相關(guān)眼病的病理改變包括眼外肌纖維化、糖胺聚糖積聚、眶脂肪容積增多。本研究旨在檢測(cè)培養(yǎng)的眼眶成纖維細(xì)胞是否存在不同的表型，表達(dá)CD90抗原有差異，并依據(jù)是否表達(dá)CD90分為兩個(gè)亞群，分離這兩個(gè)細(xì)胞亞群，分別進(jìn)行肌成纖維和脂成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)，研究他們?cè)谘弁饧±w維化、脂肪堆積和有害的炎癥中所起的不同的作用，從而解釋甲狀腺相關(guān)眼病的一系列臨床病理改變，證實(shí)成纖維細(xì)胞是甲狀腺相關(guān)眼病的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，有著高度嚴(yán)格的分工，并為進(jìn)一步闡明

2、甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病機(jī)理提供新思路，為將來(lái)研制能阻斷脂肪積聚或眼外肌纖維化的藥物或蛋白用以有針對(duì)性地治療該病提供理論依據(jù)。 方法：1.培養(yǎng)TAO病人和正常對(duì)照眼眶成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD90的表達(dá)。 2.免疫磁分離法分離CD90+和CD90-的眼眶成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定。 3.TGF-β1誘導(dǎo)CD90+和CD90-成纖維細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MFB)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)代表MFB標(biāo)

3、志的平滑肌動(dòng)蛋白α-SMA的表達(dá)情況。 4.分別誘導(dǎo)CD90+和CD90-成纖維細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化為脂成纖維細(xì)胞，比較轉(zhuǎn)化率。 5.RT-PCR法檢測(cè)MFB誘導(dǎo)過(guò)程中CD90+和CD90-成纖維細(xì)胞亞群表達(dá)代表MFB標(biāo)志的α-SMAmRNA、TGF-β1的下游基因結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGFmRNA的情況，分析時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。 6.RT-PCR法檢測(cè)MFB誘導(dǎo)過(guò)程中CD90+和CD90-成纖維細(xì)胞亞群表達(dá)與糖胺聚糖合成

4、相關(guān)的透明質(zhì)酸合成酶基因HASl、HAS2、HAS3，與炎癥相關(guān)的環(huán)氧化酶COX2基因表達(dá)的影響，更進(jìn)一步了解CD90+和CD90-眼眶成纖維細(xì)胞在TAO眼外肌纖維化、ECM聚積和炎癥過(guò)程中的作用。 結(jié)果：1.正常人、TAO患者的眼外肌、眼眶脂肪/結(jié)締組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞均有部分細(xì)胞表達(dá)CD90。眼外肌來(lái)源的成纖維細(xì)胞中CD90+的細(xì)胞比例高于眼眶脂肪/結(jié)締組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞。 2.成功地將眼眶成纖維細(xì)胞分離成兩個(gè)亞群

5、。CD90+細(xì)胞群純度大于98％；CD90-細(xì)胞群純度大于95％。分離后的細(xì)胞經(jīng)傳代表型不變化。 3.在TGF-β1的作用下，CD90+眼眶成纖維細(xì)胞于48小時(shí)后部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)α-SMA弱表達(dá)，4天時(shí)大部分細(xì)胞呈陽(yáng)性。CD90-眼眶成纖維細(xì)胞不表達(dá)α-SMA。 4.眼外肌來(lái)源CD90+成纖維細(xì)胞基本不能轉(zhuǎn)化為脂成纖維細(xì)胞。眼外肌來(lái)源的CD90-成纖維細(xì)胞、眼眶脂肪/結(jié)締組織來(lái)源的CD90+成纖維細(xì)胞、眼眶脂肪/結(jié)締組織

6、來(lái)源的CD90-脂成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化率分別為：10％、40％、72％。 5.TAO眼眶成纖維細(xì)胞在靜息狀態(tài)有一定的CTGF、α-SMA、HAS1、HAS3mRNA表達(dá)。部分病人的細(xì)胞表達(dá)HAS2mRNA，基本不表達(dá)COX2mRNA。 6.TGF-β1上調(diào)CTGFmRNA表達(dá)，3小時(shí)起效，12小時(shí)達(dá)峰值，此時(shí)CD90+細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)約為對(duì)照的13倍，CD90-成纖維細(xì)胞CTGF增加幅度較小，于3小時(shí)時(shí)增加至空白組的3

7、倍后不再上升。lng/ml及以上的濃度TGF-β1均能有效地刺激CD90+細(xì)胞CTGF的表達(dá)增加，lng/ml的濃度的TGF-β1作用小于其他較高的濃度，5ng/ml及以上的濃度作用相當(dāng)，組間兩兩分析無(wú)差異。lng/mlTGF-βl不能顯著提高CD90-眼眶成纖維細(xì)胞細(xì)胞CTGF的表達(dá)，5ng/ml及以上的濃度作用相當(dāng)，組間兩兩分析無(wú)差異。 7.TGF-β1上調(diào)α-SMAmRNA表達(dá)，CD90+細(xì)胞于24小時(shí)達(dá)峰值，并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)

8、間，約為靜息狀態(tài)的35倍；CD90-細(xì)胞α-SMA基因增加幅度明顯比CD90+細(xì)胞低，于作用3小時(shí)后，漲至靜息狀態(tài)的4倍時(shí)就不再增加，維持至12小時(shí)，然后緩慢下降。lng/ml及以上的濃度TGF-β1均能有效地刺激CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞α-SMAmRNA的表達(dá)增加(P＜0.01)，各種濃度的TGF-β1作用相當(dāng)，組間兩兩分析無(wú)顯著差異。 8.TGF-β1處理CD90+和CD90-眼眶成纖維細(xì)胞均于3小時(shí)開(kāi)始HAS1表達(dá)明

9、顯增加，6-12小時(shí)達(dá)峰值。TGF-β1所導(dǎo)致的CD90+細(xì)胞HAS1表達(dá)增加最高可達(dá)基礎(chǔ)水平的30倍左右，明顯高于CD90-細(xì)胞的8倍。大多數(shù)TAO患者的眼眶成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β1處理后，仍未能檢測(cè)出HAS2表達(dá)。TGF-β1下調(diào)HAS3表達(dá)下降，12小時(shí)時(shí)作用最強(qiáng)，CD90+細(xì)胞下降到空白組的20％左右，并保持至整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期(48小時(shí))。CD90-細(xì)胞下降到空白組的39％左右，維持至24小時(shí)。不同濃度的TGF-β1對(duì)CD90+和

10、CD90-眼眶成纖維細(xì)胞表達(dá)HAS1、HAS2、HAS3的影響沒(méi)有明顯差異。 9.經(jīng)TGF-β1處理后，CD90+和CD90-眼眶成纖維細(xì)胞均未檢測(cè)出COX2基因表達(dá)。 結(jié)論：眼眶成纖維細(xì)胞表達(dá)CD90抗原不一致，存在至少兩個(gè)細(xì)胞亞群，眼外肌來(lái)源的成纖維細(xì)胞以CD90+細(xì)胞為主，眶脂肪/結(jié)締組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞中含有較多的CD90-細(xì)胞。免疫磁珠分離法可有效地分離CD90+與CD90-細(xì)胞群。分離后的眼眶成纖維細(xì)胞表達(dá)C

11、D90穩(wěn)定，與培養(yǎng)、傳代無(wú)關(guān)。CD90+與CD90-細(xì)胞群具有不同的功能，CD90+細(xì)胞群具有轉(zhuǎn)化為MFB的潛能，與眼外肌纖維化、糖胺聚糖積聚有關(guān)；CD90-細(xì)胞群包括了具有脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化潛能的細(xì)胞群。TGF-β1上調(diào)CD90+成纖維細(xì)胞CTGF、α-SMAmRNA表達(dá)，TGF-β1通過(guò)CTGF介導(dǎo)CD90+成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MFB，并以獨(dú)特的方式參與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝：上調(diào)HAS1，下調(diào)HAS3。TGF-β1和MFB并不通過(guò)影響PGE2的合