基于氧化應(yīng)激探討中藥筋脈通對糖尿病周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)再生的作用機(jī)制.pdf

1、[研究目的]
　　從整體、細(xì)胞及分子水平，探討氧化應(yīng)激致糖尿病周圍神經(jīng)病變周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制及中藥筋脈通對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)及筋脈通含藥血清對高糖培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的作用。
　　[研究方法]
　　第一部分動物實驗
　　采用鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射SD大鼠的方法制造糖尿病模型。隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組:正常組對照組、糖尿病模型對照組、筋脈通治療組及牛磺酸治療組，每組各10只。成模后予

2、灌胃給藥，筋脈通組及?；撬峤M均按成人劑量15倍給藥，模型對照組和正常對照組灌服蒸溜水1mL/100g/d。分別于治療前及治療后4周、8周、12周及16周檢測各組大鼠體重和血糖變化。所有實驗大鼠于灌胃16周后進(jìn)行機(jī)械痛閾檢測后處死，取大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)組織。采用透射電子顯微鏡觀察DRG形態(tài)學(xué)變化，TUNEL法檢測細(xì)胞調(diào)亡，免疫組化染色法和Western blot法檢測大鼠DRG中UCP3及IGF-1蛋白的表達(dá)，實時熒光定量PCR法檢

3、測大鼠DRG中UCP3及IGF-1 mRNA的表達(dá)。
　　第二部分細(xì)胞實驗
　　1.含藥血清的制備:雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，灌胃蒸餾水（10只）制備正常對照血清，以及分別灌胃筋脈通（5只）、?；撬幔?只）制備含藥血清。
　　2.胎鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的制備:從孕15天(E15)的SD胎鼠取材制脊髓備背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRGn)，采用胰蛋白酶消化法、Neurobasal無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基+B27添加劑+NGF培養(yǎng)基進(jìn)

4、行原代培養(yǎng)，經(jīng)密度梯度離心法、差速貼壁法及有絲分裂抑制劑進(jìn)行細(xì)胞純化，抗MAP-2抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　3.將DRGn隨機(jī)分為6組:正常對照(CON)組、高糖（45mmol/L葡萄糖）組、筋脈通含藥血清原液(JMT1∶1)組、牛磺酸含藥血清原液(Tau1∶1)組、稀釋1倍?；撬岷幯?Tau1∶2)組、稀釋2倍?；撬岷幯?Tau1∶4)組，培養(yǎng)12h、24h和48h后CCK-8法分別檢測筋脈通及?；撬岷幯鍖Ω咛桥囵B(yǎng)DR

5、Gn細(xì)胞活性的影響，選擇最佳干預(yù)、后續(xù)指標(biāo)檢測時間點與?；撬岷幯鍧舛取?br>　　4.確定實驗分為4組:正常對照(CON)組、高糖(HG)組、筋脈通(JMT)組、?；撬?Tau1∶1)組，采用熒光探針法檢測DRGn活細(xì)胞中ROS水平，培養(yǎng)24 h后，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法、Western blot法檢測DRGn中UCP3及IGF-1蛋白的表達(dá)，qRT-PCR法檢測DRGn中UCP3及IGF-1 mRNA的表達(dá)。

6、
　　[研究結(jié)果]
　　第一部分動物實驗
　　1.血糖和體重監(jiān)測:STZ-DM大鼠血糖值均高于正常組(P＜0.05);各治療組血糖在同一時間點與糖尿病模型對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，兩治療組間血糖在各時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。干預(yù)前后，同一時間點各治療組大鼠之間的體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)。給藥4、8、12、16周各造模組與Con組相比體重下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　

7、　2.機(jī)械痛閾檢測:與正常組相比，DM組左、右兩側(cè)機(jī)械痛閾均顯著降低(P＜0.01);與DM組比較，JMT組及Tau組兩治療組左側(cè)機(jī)械痛閾提高(P＜0.05)，右側(cè)機(jī)械痛閾顯著提高(P＜0.01);兩治療組間比較，左、右兩側(cè)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.透射電鏡觀察背根神經(jīng)節(jié)的超微結(jié)構(gòu)變化:CON組大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（含線粒體）形態(tài)完整清晰，線粒體含量豐富且結(jié)構(gòu)正常，核膜完整。DM組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)

8、超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重度損傷，線粒體腫脹變性，線粒體外膜破壞，線粒體嵴斷裂出現(xiàn)減少甚至消失，大部分呈空泡樣變、甚至溶解。筋脈通及牛磺酸兩治療組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變程度較DM組減輕。
　　4.背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡:與CON組相比，DM組大鼠DRG中的細(xì)胞調(diào)亡率顯著升高(P＜0.01);與DM組相比，JMT與Tau兩治療組的細(xì)胞調(diào)亡率均降低，其中JMT組降低顯著(P＜0.01)，Tau組較DM組細(xì)胞調(diào)亡率降低具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.0

9、5);兩治療組間DRG組織中細(xì)胞調(diào)亡率比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　5.背根神經(jīng)節(jié)組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):
　?、倜庖呓M化法:與CON組相比，DM組DRG組織中UCP3的AOD值顯著降低(P＜0.01);與DM組比較，JMT組UCP3表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，Tau組UCP3表達(dá)與DM組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);兩治療組之間比較，JMT組DRG組織中UCP3表達(dá)與Tau組UCP3表達(dá)相比，無統(tǒng)計學(xué)差異

10、(P＞0.05)。
　?、赪estern blot法:與CON組比較，DM組的UCP3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01);與DM組比較，JMT組和Tau組UCP3蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.01);兩治療組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　?、踧RT-PCR法:與CON組相比，DM組DRG組織中與Tau治療組的UCP3mRNA值均顯著降低(P＜0.01)，JMT組的UCP3 mRNA值未見明顯差異(P＞0.05);與D

11、M組相比，JMT組DRG組織中UCP3 mRNA值顯著升高(P＜0.01)，Tau組未見明顯差異(P＞0.05);兩治療組間相比，JMT組UCP3mRNA值顯著高于Tau組(P＜0.01)。
　　6.背根神經(jīng)節(jié)組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)指標(biāo):
　　①免疫組化法:與CON組相比，DM組DRG組織中IGF-1的AOD值顯著降低(P＜0.01);與DM組比較，JMT及Tau兩治療組DRG組織中IGF-1表達(dá)均較DM組顯著升高(P＜0.

12、01);兩治療組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　?、赪estern blot法:與CON組比較，DM組DRG組織中IGF-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01);與DM組比較，JMT組和Tau組DRG組織中IGF-1蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.01);兩治療組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　③qRT-PCR法:與CON組相比，DM組DRG組織中IGF-1 mRNA值顯著降低(P＜0.01);與DM組相比，JMT

13、組和Tau組的IGF-1 mRNA值顯著升高(P＜0.01);兩治療組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　7.氧化應(yīng)激指標(biāo)UCP3與神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1相關(guān)性分析:
　　糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)UCP3與IGF-1蛋白及mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.986, r=0.977, P＜0.01)。
　　第二部分細(xì)胞實驗
　　1.細(xì)胞活性檢測:①在45mmol/L的高糖條件下各組細(xì)胞在不同時間點DRGn的活性:

14、與12h相比，DRGn在24h、48h的細(xì)胞活性顯著下降(P＜0.01);與24h相比，DRGn在48h的細(xì)胞活性繼續(xù)下降，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DRGn在45mmol/L的高糖條件下，24h這一時間點時細(xì)胞活性受到顯著抑制，作為后續(xù)實驗檢測時間點。②不同條件干預(yù)24h后:與HG組比較，JMT組及Tau1∶1組活性顯著升高(P＜0.01)，Tau1∶2及Tau1∶4組細(xì)胞活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。JMT組與不同劑量Tau

15、組比較，JMT組與Tau1∶1組細(xì)胞活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);JMT組細(xì)胞活性較Tau1∶2及Tau1:4組顯著升高(P＜0.01)。故選用?；撬岷幯逶?Tau1:1)作為陽性對照藥?；撬岬母深A(yù)濃度。
　　2.DRGn細(xì)胞調(diào)亡:與CON組比較，HG組的細(xì)胞調(diào)亡率顯著升高(P＜0.01);與HG組比較，JMT組和Tau1∶1組的細(xì)胞調(diào)亡率均顯著降低(P＜0.01)，JMT組和Tau1∶1組的細(xì)胞調(diào)亡率與CON組比較，差

16、異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);JMT組與Tau組之間比較，細(xì)胞調(diào)亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.DRGn細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):
　　①DCFH-DA熒光探針檢測DRGn中ROS:與CON組比較，HG組DRGn細(xì)胞的ROS-DCF的熒光強(qiáng)度顯著升高(P＜0.01);與HG組比較，JMT組及Tau1∶1組ROS-D)CF的熒光強(qiáng)度顯著降低(P＜0.01);JMT組與Tau組比較，ROS-DCF的熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差

17、異(P＞0.05)。
　?、诿庖邿晒夥?與CON組比較，HG組的UCP3熒光IOD值降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與HG組比較，JMT組及Tau1∶1組UCP3熒光IOD值均顯著升高(P＜0.01);JMT組及Tau組兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　?、踂estern blot法:與CON組比較，HG組的UCP3蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與HG組比較，JMT組UCP3蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)

18、意義(P＜0.05)，Tau組UCP3蛋白的表達(dá)較HG組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　④qRT-PCR法:與CON組比較，HG組UCP3 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與HG組比較，JMT組及Tau組UCP3 mRNA的表達(dá)均顯著升高(P＜0.01);兩治療組之間比較，Tau組DRGn細(xì)胞中UCP3 mRNA表達(dá)較JMT組顯著升高(P＜0.01)。
　　4.DRGn細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)指標(biāo):
　?、倜?/p>

19、疫熒光法:與CON組比較，HG組的IGF-1熒光IOD值顯著降低(P＜0.01);與HG組比較，JMT組和Tau組IGF-1熒光IOD值均顯著升高(P＜0.01);JMT組和Tau組之間IGF-1熒光IOD值無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　②Western blot法:與CON組比較，HG組的IGF-1蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與HG組比較，JMT組及Tau組IGF-1蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.01); JMT組及T

20、au組之間比較，IGF-1蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　?、踧RT-PCR法:與CON組比較，HG組IGF-1 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與HG組比較，JMT組及Tau組IGF-1 mRNA的表達(dá)均顯著升高(P＜0.01);Tau組與JMT組比較，IGF-1mRNA的表達(dá)升高更顯著(P＜0.01)。
　　5.氧化應(yīng)激指標(biāo)UCP3與神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1相關(guān)性
　　大鼠DRG細(xì)胞中UCP3與I

21、GF-1蛋白表達(dá)水平不呈線性相關(guān)(r=0.815，P＞0.05);糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)UCP3與IGF-1 mRNA表達(dá)水平不呈線性相關(guān)(r=0.769，P＞0.05)。
　　[結(jié)論]
　　第一部分動物實驗
　　1.空腹單次腹腔注射STZ60mg/kg后16周，DM大鼠出現(xiàn)痛覺過敏，提示有感覺神經(jīng)受累，DPN造模成功。
　　2.DPN大鼠背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理改變，線粒體損傷嚴(yán)重，DRG細(xì)胞凋亡率顯著升高，提

22、示DPN大鼠DRG組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。DPN大鼠背根神經(jīng)節(jié)中UCP3蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著下降，表明DRG清除高糖所致氧化應(yīng)激產(chǎn)物以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的能力下降;IGF-1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著下降，表明受損神經(jīng)修復(fù)再生能力的減弱。DPN大鼠周圍神經(jīng)修復(fù)再生能力減弱與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。
　　3.筋脈通可顯著改善DPN大鼠的痛覺過敏、抑制氧化應(yīng)激所致線粒體損傷、減少細(xì)胞凋亡，上調(diào)背根神經(jīng)組織中UCP3及IGF-1的表達(dá)，通過減少

23、線粒體ROS的生成從而減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)的損傷、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而提高神經(jīng)修復(fù)再生能力，中藥筋脈通的療效部分優(yōu)于抗氧化劑牛磺酸。
　　第二部分細(xì)胞實驗
　　1.高糖可顯著抑制DRGn細(xì)胞活性，高糖培養(yǎng)DRGn中ROS水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，DRG細(xì)胞凋亡率顯著升高;高糖培養(yǎng)DRGn中UCP3蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著下降，表明DRG細(xì)胞清除高糖所致氧化應(yīng)激產(chǎn)物以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的能力下降;IGF-1蛋白及mRNA表

24、達(dá)水平顯著下降，表明受損神經(jīng)修復(fù)再生能力的減弱。
　　2.筋脈通含藥血清能夠抑制氧化應(yīng)激所致DRGn線粒體損傷及細(xì)胞凋亡，并通過上調(diào)DRGn中UCP3表達(dá)而減少ROS的生成，減輕高糖所致氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，通過上調(diào)DRGn中IGF-1的表達(dá)而提高神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)再生能力。其作用與?；撬岷幯逑喈?dāng)。
　　綜上所述，氧化應(yīng)激為導(dǎo)致DPN大鼠周圍神經(jīng)修復(fù)再生障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)減弱與其密切相關(guān);中