瘧疾傳播阻斷疫苗新型候選抗原的篩選及其傳播阻斷效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析，原核表達(dá)、真核表達(dá)，免疫血清的傳播阻斷效果分析，基因敲除等方面研究，篩選具有傳播阻斷活性的TBV新型候選抗原。
　　方法：
　　1、四種候選抗原的來(lái)源及生物信息學(xué)分析
　　PlasmoDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取瘧原蟲(chóng)“假設(shè)蛋白”的基因信息，從中選擇四種“有性階段假設(shè)蛋白”，基因序列號(hào)分別為PBANKA_135340、PBANKA_030590、PBANKA_041720、PBANKA_0313

2、70并對(duì)這些基因進(jìn)行生物學(xué)信息，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果截取特定的區(qū)域進(jìn)行基因擴(kuò)增和重組蛋白表達(dá)。
　　2、四種候選抗原的原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體構(gòu)建
　　小鼠感染瘧原蟲(chóng)至原蟲(chóng)血癥到50％時(shí)，心臟采血，提取瘧原蟲(chóng)基因組DNA。以基因組DNA為模板PCR方法擴(kuò)增PBANKA_135340;PBANKA_030590;PBANKA_041720; PBANKA_031370截短基因，并克隆入相應(yīng)原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，酶切和

3、測(cè)序驗(yàn)證。
　　3、四種候選抗原的蛋白表達(dá)及純化
　　將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coli表達(dá)菌株RGB中進(jìn)行擴(kuò)增，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，親和層析方法純化重組蛋白。采用Bradford法檢測(cè)重組蛋白濃度。
　　4、四種候選抗原的重組蛋白免疫血清獲得
　　6～8w雌性BALB/c小鼠，分別免疫四種重組蛋白，首次免疫采用完全弗氏佐劑充分乳化后，進(jìn)行皮下注射免疫。分別于初

4、次免疫后3w和6w，以等量重組蛋白加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫。免疫前3天及免疫后2w、5w、8w進(jìn)行小鼠尾尖采血，收集免疫血清待測(cè)。同時(shí)以PBS免疫做為對(duì)照組。
　　5、重組蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性檢測(cè)。
　　應(yīng)用Western-blot方法，將重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以重組蛋白免疫血清為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，ECL發(fā)光檢測(cè)重組蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　6、四種候選抗原在瘧原蟲(chóng)各發(fā)

5、育階段表達(dá)定位。
　　體外培養(yǎng)及分離純化瘧原蟲(chóng)裂殖體、配子體、動(dòng)合子，并提取這三個(gè)階段的蟲(chóng)抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育重組蛋白免疫血清作為一抗，Western_blot方法檢測(cè)四種候選抗原在瘧原蟲(chóng)各發(fā)育階段的表達(dá)定位。
　　同時(shí)將純化后的原蟲(chóng)裂殖體、配子體、動(dòng)合子涂熒光片，加入1∶50倍稀釋重組蛋白免疫血清，通過(guò)IFA實(shí)驗(yàn)觀察四種候選抗原在瘧原蟲(chóng)各發(fā)育階段定位。
　　7、四種候選抗原的傳播阻斷效應(yīng)評(píng)價(jià)

6、>　　四種候選抗原的真核表達(dá)載體質(zhì)粒免疫小鼠，經(jīng)過(guò)3次免疫以后，用伯氏瘧原蟲(chóng)進(jìn)行攻擊，每只鼠感染P.berghei(1×107 RBC)，在感染后的第三天尾靜脈取血，加入動(dòng)合子培養(yǎng)基體外培養(yǎng)動(dòng)合子，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)動(dòng)合子形成數(shù)量。P.berghei(1×107 RBC)感染正常BALB/c小鼠，3天后收集感染小鼠血液，離心去除血清，加入四種候選抗原的重組蛋白免疫血清或PBS免疫對(duì)照血清(1∶10)重新制備血液，體外培養(yǎng)動(dòng)合子，計(jì)數(shù)動(dòng)合子

7、形成數(shù)量。用動(dòng)合子形成數(shù)量評(píng)價(jià)傳播阻斷效應(yīng)，并選擇傳播阻斷效果最明顯的一種候選抗原進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
　　8、PBANKA-041720基因敲除型瘧原蟲(chóng)獲得
　　根據(jù)PlasmoDB上提供的PBANKA-041720序列信息，設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建基因敲除載體，經(jīng)鑒定正確后，將質(zhì)粒線性化并電轉(zhuǎn)染瘧原蟲(chóng)裂殖體，裂殖體經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，給予乙胺嘧啶進(jìn)行藥物篩選。發(fā)現(xiàn)小鼠有瘧原蟲(chóng)感染后用PCR方法進(jìn)行鑒定，用生理鹽水稀釋小鼠血液進(jìn)行克隆

8、，從而獲取基因型一致瘧原蟲(chóng)。
　　9、ΔPBANKA-041720型瘧原蟲(chóng)表型與功能分析
　　P.berghei與ΔPBANKA-041720型瘧原蟲(chóng)感染鼠尾靜脈取血，體外培養(yǎng)動(dòng)合子，IFA實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)合子形態(tài)學(xué)變化。
　　P.berghei與ΔPBANKA-041720型瘧原蟲(chóng)均以(1×107 RBC)感染BALB/c小鼠，統(tǒng)計(jì)原蟲(chóng)血癥和小鼠生存率。
　　P.berghei與ΔPBANKA-041720瘧原蟲(chóng)感染

9、鼠血體外培養(yǎng)動(dòng)合子并計(jì)數(shù)動(dòng)合子形成數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　1、四種候選抗原的來(lái)源及生物信息學(xué)分析
　　本研究中選擇的四種候選抗原與間日瘧、惡性瘧均具有同源基因，選擇四種候選抗原的膜外區(qū)和抗原決定簇豐富的區(qū)域進(jìn)行基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)。
　　2、四種候選抗原原核/真核表達(dá)載體構(gòu)建
　　使用PlasmoDB網(wǎng)站獲取的基因相關(guān)信息，通過(guò)軟件primer-premier5.0設(shè)計(jì)四種候選抗原基因的真核/原核表達(dá)載體引物

10、，以基因組DNA為模板PCR方法擴(kuò)增目的基因，使用分子克隆的方法構(gòu)建真核、原核表達(dá)載體，酶切鑒定正確，測(cè)序正確。
　　3、四種候選抗原的蛋白表達(dá)與純化
　　原核載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)20℃，1mM IPTG誘導(dǎo)12h后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，可見(jiàn)大量目的蛋白表達(dá)，大小與預(yù)期結(jié)果一致。再將目的蛋白經(jīng)過(guò)His-tag親和柱純化，并對(duì)洗脫及透析后的樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)，均可清晰看到目的蛋白條帶，檢測(cè)蛋白純

11、度均在＞90％以上，濃度在0.5-1μg/μL之間可以作為抗原免疫動(dòng)物。
　　4、四種候選抗原的重組蛋白免疫血清獲得
　　通過(guò)動(dòng)物免疫獲得了四種候選抗原的重組蛋白免疫血清，并對(duì)免疫血清的抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果于初次免疫后，重組蛋白免疫組小鼠血清特異性抗體水平開(kāi)始出現(xiàn)有意義的升高。兩次加強(qiáng)免疫后抗體一直維持在較高水平，與PBS免疫對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)。說(shuō)明四種重組蛋白具有很好的免疫原性。
　　5、四種候選抗

12、原的免疫原性及反應(yīng)原性檢測(cè)
　　Western blot檢測(cè)重組蛋白免疫血清可以和純化的重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白具有免疫原性，同時(shí)重組蛋白免疫血清也可以識(shí)別瘧原蟲(chóng)抗原，證實(shí)重組蛋白具有反應(yīng)原性。
　　6、四種候選抗原在瘧原蟲(chóng)各發(fā)育階段表達(dá)定位。
　　通過(guò)western-blot方法和IFA方法對(duì)四種候選抗原在瘧原蟲(chóng)各發(fā)育階段的表達(dá)定位可知，PBANKA_030590表達(dá)在裂殖體和動(dòng)合子階段，PBANKA_1353

13、40表達(dá)在動(dòng)合子階段，PBANKA_041720表達(dá)在配子體和動(dòng)合子階段，PBANKA_031370表達(dá)在裂殖體、合子動(dòng)合子階段。
　　7、四種候選抗原的傳播阻斷效應(yīng)評(píng)價(jià)
　　真核質(zhì)粒免疫血清和重組蛋白免疫血清對(duì)四種候選抗原的傳播阻斷效應(yīng)證實(shí)，四種候選抗原均具有一定的傳播阻斷效果，其中PBANKA_041720傳播阻斷效果最明顯，阻斷動(dòng)合子形成的效率為49.12％。
　　8、ΔPBANKA_041720型瘧原蟲(chóng)獲得

14、r>　　構(gòu)建PBANKA_041720基因敲除載體，電轉(zhuǎn)染瘧原蟲(chóng)，通過(guò)PCR鑒定、有限稀釋法克隆和Southern-blot鑒定，獲得ΔPBANKA_041720型瘧原蟲(chóng)。
　　9、ΔPBANKA_041720型瘧原蟲(chóng)表型及功能分析
　　基因敲除型瘧原蟲(chóng)與野生型瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)動(dòng)合子，未能見(jiàn)到明顯差異。兩種瘧原蟲(chóng)感染小鼠后，基因敲除型瘧原蟲(chóng)感染的小鼠與野生型瘧原蟲(chóng)感染的小鼠比較生存率提高，原蟲(chóng)血癥差異不顯著。兩種瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)

15、動(dòng)合子，計(jì)數(shù)動(dòng)合子形成數(shù)量差異顯著。
　　結(jié)論：
　　1、四種候選抗原具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　2、四種候選抗原中PBANKA_031370，PBANKA_135340為配子體、合子、動(dòng)合子等瘧原蟲(chóng)有性階段表面抗原。PBANKA_030590，PBANKA_041720在裂殖體、配子體動(dòng)合子等瘧原蟲(chóng)無(wú)性和有性階段均有表達(dá)。
　　3、四種候選抗原中均有傳播阻斷效應(yīng)，其中PBANKA_041720的傳播阻斷