新型瘧原蟲傳播阻斷疫苗候選抗原Pbs54的鑒定及功能研究.pdf

1、目的：
　　基于瘧疾TBV具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價值，本項(xiàng)目采用生物信息學(xué)手段于瘧原蟲數(shù)據(jù)庫中篩選新型瘧原蟲有性生殖階段特異性膜表面蛋白PF3D7_0912200，選取其鼠瘧伯氏瘧原蟲（P.berghei）的同源基因Pbs54（PBANKA081330），截取其優(yōu)勢抗原表位區(qū)域，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建原核與真核載體，表達(dá)、純化重組蛋白，通過免疫學(xué)方法系統(tǒng)評估候選抗原的免疫活性和傳播阻斷效應(yīng)。為進(jìn)一步確定Pbs54基因的功能，

2、我們應(yīng)用同源重組技術(shù)敲除伯氏瘧原蟲基因組中的相關(guān)基因，旨在明確TBV候選蛋白對瘧原蟲發(fā)育的影響及候選蛋白的生物學(xué)功能，以期為高效瘧疾疫苗的研制開發(fā)提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、TBV候選蛋白的篩選
　　通過對瘧原蟲數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析，確定了瘧原蟲有性階段特異性蛋白為PBANKA_081330，DNA長為1368bp，蛋白分子量為53939 Da，數(shù)據(jù)庫顯示，其為瘧原蟲保守的膜蛋白，但生物學(xué)功能尚不明確

3、，存在一個信號肽及多個跨膜域，故暫命名為Pbs54。
　　2、Pbs54基因合成及原核表達(dá)載體構(gòu)建
　　P.berghei感染小鼠后第4天（配子含量豐富），從小鼠血液中獲得P.berghei總DNA。
　　3、重組蛋白的表達(dá)、純化與DNA疫苗體外瞬時表達(dá)
　　將上述PET32a(+)-Pbs54重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，至少挑選5個陽性克隆于LB培養(yǎng)基中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，Western Blot

4、驗(yàn)證蛋白正確后，大量收集蛋白樣品，使用鎳氨三乙酸瓊脂糖柱純化重組蛋白并檢測蛋白濃度。
　　4、實(shí)驗(yàn)動物免疫及血清收集
　　(1)蛋白免疫
　　于第3周和第5周再分別給予兩次加強(qiáng)免疫，50μg/小鼠（重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合）。
　　(2)核酸免疫
　　每次免疫前一天與末次免疫后第10天，尾靜脈收集每只小鼠血液，室溫凝集后收集血清。血清抗體滴度、抗血清與重組蛋白反應(yīng)的活性和特異性分別通過ELISA與Wes

5、tern Blot分析。
　　5、P.berghei裂殖體/配子體分離
　　取1μl涂布在玻片上，甲醇固定后用Giemsa染色，光鏡下計數(shù)裂殖體與配子體含量，瘧原蟲經(jīng)0.01％皂甙-PBS裂解紅細(xì)胞膜，-80℃凍存。
　　6、動合子培養(yǎng)與分離
　　取1μl涂布在玻片上，甲醇固定后用Giemsa染色檢測培養(yǎng)效果。
　　7、ELISA檢測血清特異性抗體
　　(1) rPbs54免疫:用溶解在碳酸鹽緩沖液的

6、rPbs54(6μg/ml)包被96孔酶標(biāo)板。
　　(2) PEGFP-N1-Pbs54免疫:用溶解在碳酸鹽緩沖液的瘧原蟲抗原(10μg/ml)包被96孔酶標(biāo)板。
　　8、間接免疫熒光試驗(yàn)
　　加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶100稀釋）20μl，37℃孵育60min，DAPI染色5min，封片，熒光顯微鏡觀察。
　　9、傳播阻斷效應(yīng)的觀察
　　用抗Pbs21抗體標(biāo)記培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下觀察動合子數(shù)量

7、。
　　10、候選基因的功能研究
　　(1)構(gòu)建用于獲取目的基因敲除瘧原蟲模型的質(zhì)粒載體
　　采用基因干擾方法對具有TBV能力的Pbs54蛋白進(jìn)行功能研究。
　　(2)瘧原蟲轉(zhuǎn)染
　　通過每只腹腔注射0.2ml PBS稀釋的1×106野生株P(guān).berghei，感染兩只6周齡BALB/c小鼠。感染1天后即瘧原蟲完成1次紅內(nèi)期循環(huán)，給予乙胺嘧啶飲用水，進(jìn)行藥物篩選。
　　(3) PCR檢測瘧原蟲轉(zhuǎn)染效果及

8、克隆篩選
　　設(shè)計PCR鑒定引物，引物1和2擴(kuò)增出的是野生型;引物1和3及5和6擴(kuò)增出的是發(fā)生同源重組的前端和后端序列。經(jīng)藥物篩選和PCR鑒定正確后，用鼠瘧血再感染BALB/c小鼠，至紅細(xì)胞感染率達(dá)1％左右，取血，用生理鹽水稀釋至1ml含有5個瘧原蟲，每只小鼠尾靜脈注射100μl進(jìn)行克隆，從而獲取基因型一致的瘧原蟲。
　　11、Pbs54（-）與WT瘧原蟲形態(tài)與功能的比較
　　于小鼠感染的第3天尾靜脈取10μl血液置于

9、90μl動合子培養(yǎng)液中，瘧原蟲在25℃下培養(yǎng)15min，用普通顯微鏡觀察配子出絲數(shù)。另外取10μl血液置于90μl動合子培養(yǎng)液中，瘧原蟲在19-20℃下培養(yǎng)24h，用抗Pbs21抗體標(biāo)記培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下觀察動合子數(shù)量。
　　12、統(tǒng)計分析
　　應(yīng)用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，原蟲血癥的組間比較采用Student's t檢驗(yàn)，生存曲線分析采用log-rank(mantel-cox)分

10、析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、rPbs54載體構(gòu)建及其表達(dá)、純化
　　成功構(gòu)建了PET32a(+)-Pbs54原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21表達(dá)系統(tǒng)，加入1 mM IPTG，經(jīng)20℃誘導(dǎo)20h后，SDS-PAGE電泳分析可見大量可溶性目標(biāo)蛋白Pbs54(～35kD)的表達(dá)。使用His-tag鎳氨三乙酸瓊脂糖柱純化重組蛋白，并對洗脫及透析后的樣品進(jìn)行Western blot檢測，可清

11、晰看到目標(biāo)蛋白條帶，檢測其蛋白純度＞80％，濃度可達(dá)到0.5mg/ml。
　　2、DNA疫苗的構(gòu)建及體外瞬時表達(dá)
　　成功構(gòu)建了PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗載體，經(jīng)測序后其堿基序列與Genebank公布的完全一致。應(yīng)用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒后，成功轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，培養(yǎng)24h后應(yīng)用熒光顯微鏡可見GFP綠色熒光的表達(dá)。
　　3、免疫血清特異性抗體檢測
　　(1) rPbs54免疫血清:ELIS

12、A結(jié)果顯示，于初次免疫后2周，重組蛋白免疫組小鼠血清特異性抗體水平顯著升高。兩次加強(qiáng)免疫后抗體一直維持在較高水平，與單純佐劑組相比差異顯著(P＜0.01)。重組蛋白初次免疫后，抗體效價大約為1∶20000，加強(qiáng)免疫后效價可超過1∶320000。與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(2) PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗免疫血清:ELISA結(jié)果顯示，初次免疫后3周，疫苗免疫組小鼠血清抗體水平即開始升高。兩次加強(qiáng)免疫后抗體一直維

13、持較高水平，與空質(zhì)粒組相比差異顯著(P＜0.01)。PEGFP-N1-Pbs54初次免疫后，抗體效價約為1∶1600，加強(qiáng)免疫效價達(dá)1∶3200，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4、Pbs54蛋白表達(dá)特點(diǎn)的確定
　　間接免疫熒光顯示，rPbs54重組蛋白與PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗組抗血清處理后的玻片，在熒光顯微鏡下可見帶有綠色熒光的動合子，而對照組未見綠色熒光表達(dá)的動合子。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，

14、重組蛋白與DNA疫苗組抗血清可與純化后的動合子結(jié)合形成明顯的條帶，與純化后的裂殖體、配子體可結(jié)合形成微弱的條帶，證實(shí)Pbs54蛋白主要在動合子階段表達(dá)，同時證實(shí)抗血清能夠特異性結(jié)合天然的瘧原蟲抗原。
　　5、合子、動合子培養(yǎng)及其計數(shù)
　　與對照組相比，rPbs54重組蛋白免疫后的小鼠血清與瘧原蟲共同培養(yǎng)24h后，可見動合子數(shù)量明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與對照組相比，PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗免疫后的

15、小鼠血清與瘧原蟲共同培養(yǎng)24h后，可見動合子形成數(shù)量有減少趨勢。
　　6、打靶載體的構(gòu)建
　　提取P.berghei的基因組DNA，通過在線軟件primer-BLAST設(shè)計出打靶載體構(gòu)建引物，使用引物分別PCR擴(kuò)增了所需堿基序列，并使用分子克隆方法構(gòu)建了打靶載體PLOO34-Pbs54，酶切鑒定正確，測序結(jié)果表明符合打靶要求。
　　7、Pbs54基因敲除型瘧原蟲蟲株P(guān)bs54(-)的構(gòu)建
　　使用Amaxa nu

16、cleofector技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了將線性化的PLOO34-Pbs54載體電轉(zhuǎn)染至瘧原蟲裂殖體中，并經(jīng)乙胺嘧啶篩選出重組瘧原蟲，通過有限稀釋法獲取了單個的重組瘧原蟲克隆Pbs54(-)，經(jīng)PCR方法鑒定獲得的Pbs54(-)蟲株成功導(dǎo)入了耐藥基因并成功敲除了Pbs54基因。
　　8、Pbs54(-)蟲體形態(tài)與發(fā)育觀察
　　Pbs54(-)蟲株的環(huán)狀體、裂殖體、配子體與動合子形態(tài)與野生型P.berghei比較無明顯變化，BALB

17、/c分別感染1×107個Pbs54(-)與WT瘧原蟲后，其血液階段的感染無明顯差異，配子體出絲數(shù)無明顯變化。與對照組比較，Pbs54(-)動合子形成數(shù)量減少，提示Pbs54蛋白可能在瘧原蟲有性生殖階段發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了瘧原蟲Pbs54原核表達(dá)重組蛋白(rPbs54)和Pbs54 DNA疫苗。
　　2、純化后的rPbs54與Pbs54 DNA疫苗經(jīng)動物免疫證實(shí)具有良好的免疫原性和抗原性。
　

18、　3、Pbs54蛋白主要表達(dá)于動合子表面，rPbs54與Pbs54 DNA疫苗免疫后小鼠的抗血清具有一定的傳播阻斷效應(yīng)，提示Pbs54是一種良好的新型傳播阻斷疫苗候選抗原。
　　4、利用PL0034-Pbs54基因敲除載體成功敲除了Pbs54基因，獲得了Pbs54(-)型瘧原蟲蟲株。
　　5、Pbs54(-)型蟲株與野生型P.berghei比較，其環(huán)狀體、裂殖體、配子體和動合子的形態(tài)學(xué)無明顯變化，無性階段原蟲感染率無明顯變化