新型抗心衰候選藥物-腺苷受體阻斷劑藥理學研究.pdf

1、心力衰竭(Heart failure,HF)是高血壓、冠心病、心肌病、心瓣膜病等各種心臟病的嚴重階段,是眾多心血管疾病的終末轉(zhuǎn)歸。心力衰竭病人已經(jīng)成為心血管疾病臨床住院病人的主要來源,其發(fā)病率高,5年存活率低,與惡性腫瘤相仿。心力衰竭的治療已經(jīng)成為病人、醫(yī)生和醫(yī)療保健系統(tǒng)的重荷。
　　有效的治療心力衰竭對降低心血管疾病的致殘率、致死率都具有重要的意義。目前心力衰竭的常規(guī)藥物治療是聯(lián)合使用3大類藥物,即利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑

2、(Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor,ACEI)和β受體阻滯劑。利尿劑在心力衰竭治療中起著基礎(chǔ)和關(guān)鍵的作用,其控制和緩解心力衰竭癥狀“立竿見影”,是其他任一有效“生物學治療”的基礎(chǔ)。目前,在心力衰竭治療中使用的經(jīng)典利尿劑在發(fā)揮利尿作用的同時常常會引起低血壓、以低鉀血癥為代表的電解質(zhì)紊亂和降低腎血流量和降低腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR),誘發(fā)或加重腎

3、功能損害,最終影響到對心力衰竭的臨床治療效果,甚至威脅到病人的生命。因此,具有良好利尿作用并能維持電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)、且具有保護心力衰竭患者腎功能的新型利尿藥物成為利尿藥研發(fā)的重要方向。近年來,隨著對心力衰竭病理生理學和基于利尿藥藥理學研究的快速進展,使開發(fā)基于新作用機制的利尿藥物成為可能。腺苷受體(Adenosine Receptor,AR)阻斷劑已經(jīng)成為研制抗心力衰竭的利尿藥物的新方向。
　　腺苷受體阻斷劑用于治療心力衰竭的優(yōu)勢主要表

4、現(xiàn)為此類藥物通過阻斷腺苷A1受體(A1 Adenosine Receptor,A1R)發(fā)揮利尿作用,同時能夠調(diào)節(jié)腎血管舒縮功能,改善腎血流灌注從而保護腎臟功能。腺苷激活腺苷A1受體導致腎小球入球小動脈收縮,從而降低腎小球濾過率;同時,腺苷還可刺激腎小球旁器的腎素促進血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生,加重入球小動脈收縮,導致腎小球濾過率的進一步下降。在動物以及人體試驗中發(fā)現(xiàn)阻斷腎臟中腺苷A1受體不會影響腎小管功能,并可通過改善腎小球血流量和阻斷腎小管球

5、間反饋(tubuloglomerular feedback,TGF)從而改善腎小球濾過功能。因此,腺苷受體阻斷劑不僅具有維持電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)同時發(fā)揮排鈉排水的利尿作用,更能夠通過調(diào)節(jié)腎臟血管舒縮狀態(tài),改善腎臟血流灌注,從而提高腎小球濾過率,進而保護腎臟功能。
　　腺苷受體阻斷劑依據(jù)化學結(jié)構(gòu)不同進行劃分,包括黃嘌呤類和非黃嘌呤類兩大類。目前的腺苷受體阻斷劑以黃嘌呤類居多。黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑由于其母核結(jié)構(gòu)單一,對分子結(jié)構(gòu)多樣性的變化有較

6、大的限制,導致在藥代動力學性質(zhì)優(yōu)化、高親和力和高選擇性化合物的化學合成篩選方面存在明顯的局限性。而非黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑由于化學母核結(jié)構(gòu)的多樣性、組織選擇性高的優(yōu)勢,已經(jīng)成為腺苷受體阻斷劑研發(fā)的新趨勢。
　　鑒于以上研究背景,本課題旨在針對自主研發(fā)的2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4,3-c]喹啉-3-酮衍生物進行篩選,獲得高親和力、高選擇性,具有明確利尿腎功能保護作用且藥代動力學性質(zhì)較為理想的新型非黃嘌呤類腺苷A1受體

7、阻斷劑。本研究的主要發(fā)現(xiàn)包括:
　　一、篩選獲得高親和力、高選擇性新型非黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑
　　首先,我們建立了穩(wěn)定表達人源A1R的CHO-K1細胞株和穩(wěn)定表達人源A2AR的HEK-293細胞株。在大鼠腦組織和穩(wěn)定表達腺苷受體的細胞體系中,采用放射配體受體競爭實驗,在兩個(10-5、10-7M)濃度下,對30個2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4,3-c]喹啉-3-酮衍生物進行篩選,獲得8個對A1R具有高親和力的化

8、合物。在此基礎(chǔ)上,用定量藥理學的方法獲得了這8個化合物和標記配體競爭性與A1R結(jié)合的Ki值。PQ-69(0.955nM)、PQ-81(46.5nM)、PQ-83(0.90nM)、PQ-85(1.57nM)、PQ-86(7.07nM)、PQ-88(55.8nM)、PQ-103(1.54nM)、PQ-107(1.07nM);它們對A2AR的Ki值分別為:PQ-69(208nM)、PQ-81(67.8nM)、PQ-83(109nM)、PQ-8

9、5(52.6nM)、PQ-86(247nM)、PQ-88(1240nM)、PQ-103(154nM)、PQ-107(170nM)。A1R/A2AR的選擇倍數(shù)分別為PQ-69(217倍)、PQ-81(1.46倍)、PQ-83(120倍)、PQ-85(33.6倍)、PQ-86(35倍)、PQ-88(22.2倍)、PQ-103(99.9倍)、PQ-107(159倍)。同時在已建立的表達多種G-蛋白偶聯(lián)受體(G-proteinCoupledRe

10、ceptors,GPCR)的穩(wěn)定細胞系上比較了該類化合物對其他GPCR受體的親和力,發(fā)現(xiàn)該類化合物對多巴胺D1、D2、D3受體,膽堿M4、M5受體,腎上腺素α1A、α1B受體的親和力均較低,對A1R的選擇倍數(shù)都大于1000倍。與文獻報道的非黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑相比,該類化合物屬于高親和力和高選擇性的化合物,尤其是PQ-69和PQ-83。PQ-69和PQ-83對A1R的親和力和選擇性與文獻報道已知的高選擇性A1R阻斷劑1,3-Dipro

11、pyl-8-cyclopentyl xanthine(DPCPX)相當或略高。PQ-69、PQ-83、DPCPX對A1R的Ki值分別為:0.955、0.9、1.9nM;A1R/A2AR的選擇倍數(shù)為208、109、52.6倍。
　　其次,通過[35S]-GTPγS(guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate)結(jié)合實驗在G蛋白分子水平上證實2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4,3-c]喹啉-

12、3-酮衍生物本身不能激動A1R,是A1R的阻斷劑。此外,我們還發(fā)現(xiàn)PQ-69和PQ-83能夠降低[35S]-GTPγS的基礎(chǔ)結(jié)合量,提示他們具有反向激動A1R的特點。進一步通過檢測G蛋白激活后第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的變化,確證PQ-69和PQ-83兼具A1R阻斷劑和反向激動劑的特性。
　　此外,我們還在豚鼠離體氣管條上評價了PQ-69和PQ-83阻斷A1R激動劑

13、的作用強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PQ-69和PQ-83可以濃度依賴性地顯著抑制A1R激動劑2-Chloro-N6-cyclopentyladenosine(CCPA)收縮氣管條的作用,拮抗CCPA的作用強,拮抗活性與選擇性A1R阻斷劑DPCPX相當。PQ-69、PQ-83和DPCPX的pA2值分別為8.99、9.54、8.11;Schild Slope值分別為1.3、1.1、1.2。而且,PQ-69(10-10-10-6M)自身能濃度依賴性地舒張

14、靜息狀態(tài)的離體氣管條,拮抗內(nèi)源性腺苷對氣管條的收縮作用。因此,PQ-69和PQ-83在離體組織水平表現(xiàn)出競爭性A1R阻斷劑的特點。
　　二、PQ-69和PQ-83早期藥代動力學研究
　　通過計算機預測藥代動力學性質(zhì),表明2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4,3-c]喹啉-3-酮衍生物的溶解性質(zhì)、吸收性質(zhì)良好。在此基礎(chǔ)上,本文進一步對PQ-69、PQ-83及選擇性A1R阻斷劑DPCPX的藥代動力學性質(zhì)進行研究。在大鼠上,

15、靜脈(intravenous,i.v.)和灌胃(peros,p.o.)給予PQ-69,其半衰期明顯長于PQ-83和DPCPX,靜脈半衰期分別為7.92、3.71、2.36小時;灌胃半衰期分別為9.69、3.16、5.85小時;在大鼠和人肝微粒體模型中,PQ-69和PQ-83孵育60min后剩余量均大于70％,與陽性化合物DPCPX相比,代謝緩慢,性質(zhì)穩(wěn)定;在Caco-2細胞模型上,PQ-69的透膜性質(zhì)優(yōu)于PQ-83。這些實驗結(jié)果提示PQ

16、-69的藥代動力學性質(zhì)明顯優(yōu)于DPCPX。
　　三、PQ-69早期急性毒性研究
　　對PQ-69進行初步的早期毒性研究,5只雄性小鼠灌胃給予PQ-69(840mg/kg),未出現(xiàn)死亡,14天后未表現(xiàn)任何不良反應;7只小鼠灌胃給予PQ-69(2100mg/kg),其中3只雄性鼠,4只雌性鼠均未發(fā)生死亡,14天后未表現(xiàn)任何不良反應。
　　四、PQ-69在正常大鼠及順鉑所致急性腎功能衰竭大鼠利尿及腎功能保護作用
　　1

17、、PQ-69(30mg/kg,p.o.)能夠顯著增加正常大鼠尿量(P﹤0.001);PQ-69(10mg/kg,p.o.)能夠顯著增加大鼠鈉離子排泄(P﹤0.05)。PQ-69(0.03、0.3、1、3mg/kg,i.v.)能夠劑量依賴地顯著增加大鼠尿量,PQ-69(0.3mg/kg,i.v.)與氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide,HCTZ)(1mg/kg,i.v.)及DPCPX(1mg/kg,i.v.)增加尿量相當,均能

18、明顯增加大鼠尿量;PQ-69(0.03、0.3、1、3mg/kg,i.v.)劑量依賴性的顯著增加鈉離子、氯離子排泄,與高效利尿劑呋塞米(Furosemide,FURO)(6mg/kg,i.v.)、中效利尿劑氫氯噻嗪(1mg/kg,i.v.)既顯著增加鈉離子、氯離子排泄,同時又顯著增加鉀離子排泄相比,PQ-69靜脈給藥對鉀離子排泄影響較小,提示PQ-69在發(fā)揮利尿,增加鈉離子、氯離子排泄作用的同時能夠較少影響鉀離子排泄,維持電解質(zhì)的平衡。

19、
　　2、在順鉑(5mg/kg,i.v.)致急性腎功能衰竭大鼠模型上,PQ-69(10、30mg/kg,p.o.)與模型組相比呈現(xiàn)增加大鼠尿量趨勢。與高效利尿劑FURO(30mg/kg,p.o.)、中效利尿劑HCTZ(3mg/kg,p.o.)不能改善順鉑造成的大鼠肌酐清除率顯著降低不同,PQ-69(3、10、30mg/kg,p.o.)能夠恢復大鼠肌酐清除率至正常水平,提示PQ-69具有利尿和腎功能保護作用。
　　3、在順鉑(

20、4mg/kg,i.v.)致急性腎功能衰竭大鼠模型上,PQ-69(0.01、0.1、1mg/kg,i.v.)與DPCPX(0.1、1mg/kg,i.v.)均能劑量依賴地顯著增加大鼠尿量和鈉離子、氯離子排泄(P﹤0.05)。與高效利尿劑FURO(6mg/kg,i.v.)顯著增加鉀離子排泄相比,DPCPX(1mg/kg,i.v.)和PQ-69(0.01、0.1、1mg/kg,i.v.)對鉀離子排泄都沒有影響。
　　此外,高效利尿劑FUR

21、O(6mg/kg,i.v.)、中效利尿劑HCTZ(1mg/kg,i.v.)對模型大鼠肌酐清除率顯著降低沒有明顯改善作用,而PQ-69(0.1mg/kg,P﹤0.05)、DPCPX(0.1mg/kg,P﹤0.05)與模型組相比,能顯著增加大鼠肌酐清除率,提示PQ-69在發(fā)揮利尿、增加鈉離子、氯離子排泄作用的同時能夠不影響鉀離子排泄,維持電解質(zhì)平衡,增加肌酐清除率,具有腎功能保護作用。
　　4、通過對腎臟病理形態(tài)學進行分析,發(fā)現(xiàn)順鉑(

22、4mg/kg,i.v.)導致大鼠出現(xiàn)病理損傷,腎皮質(zhì)明顯變薄,腎小管上皮細胞腫脹,偶見遠曲小管蛋白管形,但腎髓質(zhì)中腎小球結(jié)構(gòu)基本正常。PQ-69(0.1mg/kg,i.v.)與DPCPX(0.1mg/kg,i.v.)相比,能夠改善模型組大鼠腎臟皮質(zhì)變薄、近曲小管上皮細胞腫脹等病理損傷。通過實時定量PCR方法檢測腎臟A1R和A2AR的mRNA表達水平,順鉑(4mg/kg,i.v.)能顯著增加大鼠A1R(P﹤0.001)和A2AR(P﹤0.

23、05)mRNA的表達。通過蛋白免疫印跡法檢測腎臟A1R、A2AR的表達,順鉑(4mg/kg,i.v.)造成大鼠腎臟A1R、A2AR蛋白含量表達有增加的趨勢,提示PQ-69抗順鉑所致腎功能損傷作用可能是通過阻斷或部分阻斷A1R的表達上調(diào)實現(xiàn)。
　　綜上所述,本研究通過篩選獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高親和力、高選擇性的2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4,3-c]喹啉-3-酮結(jié)構(gòu)的A1R阻斷劑,其中PQ-69對A1R親和力和選擇性