長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　冠心?。╟oronary artery disease，CAD）嚴(yán)重危害人類健康，是全球范圍內(nèi)致死和致殘的主要原因之一。冠心病是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）所導(dǎo)致器官病變的常見類型，由于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展是多因素介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)的過(guò)程，其分子機(jī)制尚未完全闡明。近幾年的研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(longnoncoding RNAs，lncRNAs)廣泛參與生理病理機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后

2、水平等多層面調(diào)控基因的表達(dá)，因此可能成為具有疾病診斷和治療價(jià)值的新分子。既往研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1(taurine up-regulated1)在腫瘤等疾病中具有重要的調(diào)節(jié)功能，且TUG1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)豐度較高。但目前TUG1與心血管疾病的關(guān)系尚無(wú)研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)病例對(duì)照分析和功能機(jī)制等方面的研究，探索TUG1與內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，為冠心病的預(yù)防和治療提供新的思路和方向。
　　方法:

3、　　1.采用病例對(duì)照研究方法，納入54例冠心病患者和75例健康對(duì)照，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)提取總RNA，應(yīng)用real-time PCR方法檢測(cè)病例組和對(duì)照組PBMCs中TUG1表達(dá)水平的差異。
　　2.采用敲低策略研究TUG1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)中的功能及分子機(jī)

4、制。在HUVECs中采用RNAimax轉(zhuǎn)染siRNA敲低TUG1的表達(dá)，檢測(cè)TUG1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、增殖的影響，以及與細(xì)胞間粘附分子（ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子（VCAM-1）表達(dá)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號(hào)通路的關(guān)系。采用AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和MTT比色法分別檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和增殖活性。利用HERAcell150i低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱建立內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷模型，利用腫瘤壞死因子TNF-α建立

5、炎癥損傷模型。應(yīng)用real-time PCR和Western blot方法，分別檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TUG1表達(dá)水平在病例組中顯著升高，在冠心病病例組中的表達(dá)水平是對(duì)照組的1.4倍，結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　2.在HUVECs中，TUG1的表達(dá)豐度相對(duì)較高。采用siRNA敲低TUG1表達(dá)抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖

6、(P＜0.05)。同時(shí)，在低氧及炎癥因子TNF-α刺激的細(xì)胞損傷模型中，敲低TUG1表達(dá)同樣抑制低氧和TNF-α損傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(P＜0.05)。
　　3.在HUVECs中敲低TUG1表達(dá)后，抑制細(xì)胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05);敲低TUG1后抑制TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　4.在正常生理培養(yǎng)下或TNF-α刺激的條件下，敲低

7、TUG1表達(dá)后，p38 MAPK通路p38蛋白的磷酸化水平均顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本研究通過(guò)冠心病病例對(duì)照研究和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探索了lncRNA TUG1在冠心病及內(nèi)皮細(xì)胞中的功能。TUG1在冠心病病例組的PBMCs樣本中表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，提示該lncRNA可能參與冠心病的發(fā)生過(guò)程。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲低TUG1能抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少低氧及TNF-α刺激下內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，降低細(xì)胞粘附因子ICAM