神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子受體4和長鏈非編碼RNA TUG1調(diào)控血腫瘤屏障通透性和膠質(zhì)瘤血管新生的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究的主要目的旨在明確Robo4、TUG1在調(diào)節(jié)BTB通透性和膠質(zhì)瘤血管新生的可能作用和相關(guān)機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路和作用靶點。
　　方法：
　　1.應(yīng)用Real-time PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測Robo4在正常人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮(GEC)中的表達(dá)和定位。
　　2.構(gòu)建體外血腫瘤屏障模型，利用穩(wěn)定過表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默人腦微血管

2、內(nèi)皮細(xì)胞建立相應(yīng)的體外BTB模型。
　　3.跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻檢測和辣根過氧化物酶(HRP)滲透實驗，明確Robo4表達(dá)變化后對BTB通透性的影響。
　　4.給予Robo4激活性配體Slit2N預(yù)處理24小時后，檢測跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻和HRP滲透實驗，明確Robo4激活性配體Slit2N在Robo4調(diào)控BTB通透性中的作用。
　　5.應(yīng)用Western blot和細(xì)胞免疫熒光法檢測穩(wěn)定過表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦

3、微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立的體外BTB模型中內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)變化。
　　6.應(yīng)用Western blot和明膠酶譜法檢測穩(wěn)定過表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立的體外BTB模型的內(nèi)皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性變化。
　　7.給予基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001預(yù)處理24小時后，檢測跨內(nèi)皮細(xì)胞阻和HRP滲透實驗，明確基質(zhì)金屬

4、蛋白酶MMP-2、MMP-9在Robo4調(diào)控BTB通透性中的作用，Western blot檢測MMP-2、MMP-9在Robo4調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)過程中的作用。
　　8.應(yīng)用Western blot檢測穩(wěn)定過表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立的體外BTB模型的內(nèi)皮細(xì)胞中Robo4相關(guān)信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子(Src、Erk1/2)的表達(dá)和磷酸化水平變

5、化。
　　9.給予Src抑制劑PP2(抑制Tyr-416磷酸化位點)和Erk1/2抑制劑PD98059(抑制Erk1/2磷酸化)預(yù)處理24小時后，跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻和HRP滲透實驗檢測BTB模型通透性變化，Western blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5表達(dá)變化，應(yīng)用Western blot和明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性變化。
　　10.采用膠質(zhì)

6、瘤條件培養(yǎng)方法，通過CCK-8細(xì)胞增殖實驗、Transwell小室遷移實驗、Matrigel tube體外血管形成實驗，明確膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、體外成血管能力的影響。
　　11.穩(wěn)定過表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，CCK-8細(xì)胞增殖實驗、Transwell小室遷移實驗、Matrigel tube體外血管形成實驗，研究Robo4表達(dá)變化對膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、體外成血管能力的影響。

7、
　　12.分別給予Robo4激活性配體Slit2N和（或）血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF-165，明確Slit2N和VEGF-165在Robo4調(diào)控的膠質(zhì)瘤血管新生中的作用。
　　13.應(yīng)用Western blot檢測膠質(zhì)瘤微環(huán)境下過表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Robo4相關(guān)信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子(VEGFR2、PI3K、AKT、FAK)的表達(dá)和磷酸化水平變化。
　　14.膠質(zhì)瘤微環(huán)境下的Ro

8、bo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別給予VEGFR2抑制劑SU-1498，AKT抑制劑LY294002和FAK抑制劑FAK inhibitor14預(yù)處理24小時后，檢測對膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、體外成血管能力的影響。
　　15.激光捕獲顯微切割獲得正常人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，Real-time PCR、原位雜交法檢測正常人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮中TUG1的表達(dá)和定位。
　　結(jié)果：
　　

9、1.Robo4在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)，且在人膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2.成功建立了人血腫瘤屏障體外模型，并成功構(gòu)建了基于穩(wěn)定過表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建的相應(yīng)的體外血腫瘤屏障模型。
　　3.內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)Robo4使BTB模型TEER值顯著增高，HRP滲透率顯著降低;Robo4表達(dá)沉默使BTB模型的TEER值顯著降低，HRP滲透率顯著增高。
　　4.Robo4的表達(dá)變

10、化改變BTB通透性的過程中，是通過配體Slit2與Robo4結(jié)合起作用的。
　　5.內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)Robo4使緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)顯著增加;內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)顯著減少，由連續(xù)分布變?yōu)椴贿B續(xù)分布。
　　6.內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)Robo4使MMP-9的表達(dá)和活性顯著降低;內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使MMP-9的

11、表達(dá)顯著上調(diào)，活性顯著增加。而基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)和活性未見顯著改變。
　　7.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001預(yù)處理部分阻斷了Robo4表達(dá)沉默對BTB通透性和緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)的影響。
　　8.內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)Robo4使內(nèi)皮細(xì)胞Src和Erk1/2的磷酸化水平顯著降低;內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使內(nèi)皮細(xì)胞Src和Erk1/2的磷酸化水平顯著升高。
　　9.Src抑制劑PP2和E

12、rk1/2抑制劑PD98059部分阻斷了Robo4表達(dá)沉默對BTB通透性和緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5表達(dá)的影響，同時部分阻斷Robo4表達(dá)沉默導(dǎo)致的MMP-9的活性和表達(dá)增加的作用效果。
　　10.膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增強(qiáng)其體外成血管能力。
　　11.內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Robo4抑制膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體外成血管。
　　12.內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)Robo4使內(nèi)皮細(xì)

13、胞VEGFR2、PI3K、AKT和FAK磷酸化水平顯著下調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2、PI3K、AKT和FAK磷酸化水平顯著上調(diào)。Robo4抑制膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2介導(dǎo)的PI3K/AKT和FAK信號通路的激活。
　　13.VEGFR2抑制齊劑 SU-1498、AKT抑制齊劑 LY294002、FAK抑制齊劑 FAK inhibitor14部分阻斷了Robo4抑制膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)下的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移

14、和形成血管的作用。
　　14.TUG1在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)。沉默TUG1降低GEC緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá)，增加BTB通透性。
　　15.MiR-144在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)。過表達(dá)miR-144降低GEC緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá)，增加BTB通透性。
　　16.TUG1與miR-144存在靶向結(jié)合作用。
　　

15、結(jié)論：
　　1.Robo4在正常人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在內(nèi)源性表達(dá)，在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2.膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默能夠顯著降低緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)，增加BTB通透性，其機(jī)制是通過激活Src-Erk1/2信號通路，增加MMP-9的表達(dá)和活性實現(xiàn)。
　　3.Robo4的表達(dá)變化改變BTB通透性的過程中，是通過配體Slit2與Robo4

16、結(jié)合發(fā)揮作用。
　　4.Robo4通過抑制VEGFR2介導(dǎo)的PI3K-AKT和FAK信號通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體外成血管的作用。
　　5.TUG1、miR-144、HSF2在正常人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在內(nèi)源性表達(dá)，TUG1和HSF2在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，miR-144在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)。
　　6.膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞TUG1表達(dá)沉默通過上調(diào)miR-144的表達(dá)，顯

17、著降低緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá)，增加BTB通透性。
　　7.膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-144過表達(dá)通過靶向結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HSF2并下調(diào)其表達(dá)，進(jìn)而降低緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá)，增加BTB通透性。
　　8.轉(zhuǎn)錄因子HSF2與緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的啟動子區(qū)結(jié)合，增加其啟動子活性。
　　9.TUG