天花粉蛋白基因工程菌株發(fā)酵條件及產(chǎn)物抗病毒實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)是從栝樓根鮮汁中得到的一種蛋白質(zhì)。我們將小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0細(xì)胞)與經(jīng)TCS免疫過的小鼠脾細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，挑選可以分泌TCS單克隆抗體的細(xì)胞系，再經(jīng)克隆化為單克隆細(xì)胞系。用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)此細(xì)胞系分泌單克隆抗體情況。經(jīng)細(xì)胞融合和2次克隆化后，獲得1株可以穩(wěn)定分泌TCS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，ELISA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。此雜交瘤細(xì)胞系可以

2、穩(wěn)定分泌天花粉蛋白單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了TCS單克隆抗體檢測(cè)方法，為TCS的鑒定提供了快速、便捷、準(zhǔn)確的方法。 本文還研究了溫度、PH值、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、接種量、誘導(dǎo)劑濃度等6種因素對(duì)于天花粉蛋白基因工程菌株T239表達(dá)量的影響，優(yōu)化了培養(yǎng)及表達(dá)條件，以達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。發(fā)現(xiàn)此菌株在溫度30℃、PH值7.3、搖床轉(zhuǎn)速200r/min、50ml/500ml培養(yǎng)瓶、接種量3％、培養(yǎng)時(shí)間30h、添加葡萄糖濃度為2.0

3、g/L時(shí)，表達(dá)量最高。 進(jìn)一步我們對(duì)菌株T239表達(dá)獲得的天花粉蛋白抗人免疫缺陷病毒的活性進(jìn)行了研究。將人免疫缺陷病毒1型在細(xì)胞系中培養(yǎng)，加入表達(dá)獲得的天花粉蛋白后，觀察細(xì)胞病變情況，檢測(cè)P24抗原及逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組細(xì)胞在第7天以后均出現(xiàn)人免疫缺陷病毒1型感染典型細(xì)胞病變，P24抗原及逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)均為陽(yáng)性；陽(yáng)性對(duì)照組始終未見HIV-1感染典型細(xì)胞病變，逆轉(zhuǎn)錄酶的活性檢測(cè)和P24抗原檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明實(shí)驗(yàn)設(shè)

4、計(jì)合理。發(fā)現(xiàn)加入天花粉蛋白的細(xì)胞始終未見細(xì)胞病變，P24抗原及逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)均為陰性，因此可以認(rèn)定我們用基因工程的方法表達(dá)獲得的天花粉蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞系中可以有效抑制人免疫缺陷病毒1型。再將單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型在細(xì)胞系中培養(yǎng)，加入天花粉蛋白后，觀察細(xì)胞病變情況，用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法檢測(cè)病毒生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞在第3天以后均出現(xiàn)單純皰疹病毒1型及單純皰疹病毒2型感染典型細(xì)胞病變，ELISA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)