天花粉蛋白基因工程菌株發(fā)酵條件及產(chǎn)物抗病毒實驗研究.pdf

1、天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)是從栝樓根鮮汁中得到的一種蛋白質(zhì)。我們將小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0細胞)與經(jīng)TCS免疫過的小鼠脾細胞融合，融合后的細胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中進行選擇性培養(yǎng)，挑選可以分泌TCS單克隆抗體的細胞系，再經(jīng)克隆化為單克隆細胞系。用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測此細胞系分泌單克隆抗體情況。經(jīng)細胞融合和2次克隆化后，獲得1株可以穩(wěn)定分泌TCS單克隆抗體的雜交瘤細胞系，ELISA檢測結(jié)果為陽性。此雜交瘤細胞系可以

2、穩(wěn)定分泌天花粉蛋白單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了TCS單克隆抗體檢測方法，為TCS的鑒定提供了快速、便捷、準確的方法。 本文還研究了溫度、PH值、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、接種量、誘導(dǎo)劑濃度等6種因素對于天花粉蛋白基因工程菌株T239表達量的影響，優(yōu)化了培養(yǎng)及表達條件，以達到提高產(chǎn)量的目的。發(fā)現(xiàn)此菌株在溫度30℃、PH值7.3、搖床轉(zhuǎn)速200r/min、50ml/500ml培養(yǎng)瓶、接種量3％、培養(yǎng)時間30h、添加葡萄糖濃度為2.0

3、g/L時，表達量最高。 進一步我們對菌株T239表達獲得的天花粉蛋白抗人免疫缺陷病毒的活性進行了研究。將人免疫缺陷病毒1型在細胞系中培養(yǎng)，加入表達獲得的天花粉蛋白后，觀察細胞病變情況，檢測P24抗原及逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對照組細胞在第7天以后均出現(xiàn)人免疫缺陷病毒1型感染典型細胞病變，P24抗原及逆轉(zhuǎn)錄酶檢測均為陽性；陽性對照組始終未見HIV-1感染典型細胞病變，逆轉(zhuǎn)錄酶的活性檢測和P24抗原檢測結(jié)果均為陰性，說明實驗設(shè)

4、計合理。發(fā)現(xiàn)加入天花粉蛋白的細胞始終未見細胞病變，P24抗原及逆轉(zhuǎn)錄酶檢測均為陰性，因此可以認定我們用基因工程的方法表達獲得的天花粉蛋白在培養(yǎng)細胞系中可以有效抑制人免疫缺陷病毒1型。再將單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型在細胞系中培養(yǎng)，加入天花粉蛋白后，觀察細胞病變情況，用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法檢測病毒生長情況。結(jié)果顯示，陰性對照組細胞在第3天以后均出現(xiàn)單純皰疹病毒1型及單純皰疹病毒2型感染典型細胞病變，ELISA檢測結(jié)果為陽