Cx43對(duì)休克大鼠血管滲漏和血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制.pdf

1、休克為創(chuàng)傷最常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率和死亡率都很高。嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克病人廣泛存在血管功能下降，主要包括兩個(gè)方面:一是休克后血管反應(yīng)性下降，即是全身血管對(duì)內(nèi)源性和外源性血管舒縮物質(zhì)反應(yīng)性降低或是不反應(yīng)。這種血管的低反應(yīng)性嚴(yán)重影響休克的發(fā)生發(fā)展及治療，是導(dǎo)致休克晚期血壓難以回升和致死的主要原因之一。二是休克后血管屏障功能下降，即血管滲漏，也叫血管通透性升高，特別是創(chuàng)傷失血休克繼發(fā)的嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克。血管滲漏可使血管內(nèi)液體外滲，導(dǎo)致組織水腫

2、和有效循環(huán)量的進(jìn)一步下降，影響組織和器官功能，并最終發(fā)展為多器官功能障礙(MODS)，其死亡率高達(dá)40-70％。
　　目前研究證實(shí)血管低反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制主要有:血管平滑肌細(xì)胞膜受體失敏機(jī)制、膜超極化及我們實(shí)驗(yàn)室提出的鈣失敏學(xué)說。血管滲漏的機(jī)制主要包括兩種途徑:跨內(nèi)皮細(xì)胞途徑和內(nèi)皮細(xì)胞旁途徑。這兩種途徑在休克血管滲漏中發(fā)揮著主要作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，凝血酶（thrombin），TNF-α等多種細(xì)胞因子主要也是通過這兩條

3、通路來影響血管的屏障功能。
　　縫隙連接是一種細(xì)胞間的重要結(jié)構(gòu)，在血管中呈現(xiàn)高表達(dá)，可介導(dǎo)細(xì)胞間多種電化學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)，參與多種血管功能的調(diào)控。Cx43是細(xì)胞間縫隙連接的主要構(gòu)成蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Cx43在多種血管疾病中發(fā)揮重要的作用，如:動(dòng)脈粥樣硬化，高血壓等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Cx43參與休克后血管反應(yīng)性的調(diào)控，但其機(jī)制不清。最近有研究顯示在酸吸入所導(dǎo)致的急性肺損傷中，Cx43的表達(dá)在肺血管的通透性變化中發(fā)揮重要作用，那么縫隙連接蛋白

4、Cx43是否會(huì)參與在休克后血管滲漏的調(diào)節(jié)，機(jī)制如何？目前尚不清楚。
　　研究已證實(shí)Rho激酶信號(hào)通路和PKC信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、引起細(xì)胞收縮和細(xì)胞遷移等方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用。我們前期的研究證實(shí)Rho激酶通路和PKC信號(hào)通路在休克后血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。另外也有研究發(fā)現(xiàn)在血管滲漏方面，Rho激酶通路也起著關(guān)鍵的作用，如RhoA/Rock通路介導(dǎo)了凝血酶引起的血管內(nèi)皮通透性的增加。研究證實(shí)骨橋蛋白可作為一種信號(hào)分子參與

5、與血管相關(guān)的多種病理生理變化的調(diào)節(jié):如細(xì)胞粘附，血管生成和細(xì)胞遷移。例如OPN通過改變內(nèi)皮屏障功能介導(dǎo)了由VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。此外， OPN可激活FAK和ERK信號(hào)通路，而這些信號(hào)通路可導(dǎo)致細(xì)胞的剛度變化和細(xì)胞骨架重排。這些生理和病理事件都提示OPN可能與血管內(nèi)皮屏障功能有密切的關(guān)系，但具體的機(jī)制不清楚。那么Rho激酶通路和OPN是否參與休克后Cx43對(duì)血管滲漏和血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)呢，尚不清楚。
　　目的：
　　首先利用嚴(yán)

6、重膿毒癥大鼠模型和體外LPS刺激肺靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究了Cx43在嚴(yán)重膿毒癥血管滲漏中的作用及其與Rho激酶，PKC和OPN的關(guān)系;第二，利用大鼠出血性休克模型，以及缺血缺氧處理的血管環(huán)和血管平滑肌細(xì)胞研究了Cx43在休克血管反應(yīng)性調(diào)節(jié)中的作用及其與Rho激酶和PKC的關(guān)系。
　　方法:
　　第一部分 Cx43在調(diào)節(jié)嚴(yán)重膿毒癥大鼠血管滲漏中的作用及機(jī)制。
　　1.初步探討Cx43在嚴(yán)重膿毒癥血管滲漏中的作用:利用嚴(yán)重

7、膿毒癥大鼠及LPS刺激的肺靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)，觀察血管滲漏情況和血管Cx43蛋白表達(dá)變化;利用慢病毒轉(zhuǎn)染肺靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變Cx43的表達(dá)，測(cè)定了單層VECs的TER和對(duì)熒光白蛋白(FITC-BSA)透過率的變化。
　　2.Rho激酶在Cx43調(diào)節(jié)血管滲漏中的作用及機(jī)制研究:利用Cx43高表達(dá)和正常的肺靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察Rho激酶抑制劑對(duì)Cx43調(diào)節(jié)休克血管滲漏的影響及Cx43對(duì)Rho激酶表達(dá)的影響。
　　3

8、.OPN/緊密連接蛋白在Cx43調(diào)節(jié)休克血管滲漏中的作用及機(jī)制研究:利用嚴(yán)重膿毒癥大鼠和LPS刺激的肺靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，測(cè)定OPN，zo-1，claudin-5表達(dá)變化及血管滲漏的變化，及OPN的RNA干擾對(duì)血管滲漏及zo-1和claudin-5表達(dá)的影響;及利用Cx43轉(zhuǎn)染的肺靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察Cx43對(duì)OPN表達(dá)的影響及Cx43對(duì)OPN上游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響。
　　第二部分 Cx43在調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管低反應(yīng)性中的作用

9、及機(jī)制。
　　1.Cx43在PDGF調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性中的作用及與PKC和Rho激酶的關(guān)系:利用失血性休克大鼠及缺氧血管環(huán)，觀察MEGJ阻斷劑和Cx43AODN對(duì)休克血管鈣敏感性和反應(yīng)性的影響;利用血管平滑肌細(xì)胞，觀察了Rho激酶和PKC的抑制劑在PDGF調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性中的作用，及Cx43AODN在PDGF調(diào)節(jié)Rho激酶和PKC活性中的作用。
　　2.Cx43在BK調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性中的作用及機(jī)制:利用失血性休克大鼠缺氧處理的血管環(huán)

10、，觀察MEGJ阻斷劑18α-GA對(duì)血管反應(yīng)性的影響，及Rho激酶和PKC抑制劑在Cx43介導(dǎo)BK調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性中的作用及機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　第一部分 Cx43對(duì)嚴(yán)重膿毒癥血管滲漏的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制
　?。ㄒ唬〤x43在嚴(yán)重膿毒癥血管滲漏中的作用
　　Cx43參與了嚴(yán)重膿毒癥血管血管滲漏的發(fā)生，Cx43表達(dá)變化與通透性變化呈正相關(guān)，改變Cx43的表達(dá)可顯著調(diào)節(jié)血管滲漏。提示Cx43在嚴(yán)重膿毒癥血管滲漏中發(fā)揮重

11、要的作用。
　?。ǘ㏑ho激酶-MLC20在Cx43調(diào)節(jié)血管滲漏中的作用及機(jī)制研究
　　LPS刺激和Cx43高表達(dá)可顯著升高白蛋白的透過率和降低TER值，改變內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激纖維的形態(tài)，使細(xì)胞呈現(xiàn)向中心收縮。Rho激酶抑制劑Y-27632可減輕透過率的升高和TER值的降低及抑制細(xì)胞向心收縮。LPS刺激和Cx43高表達(dá)可顯著性升高Rho激酶的表達(dá)，Cx43RNAi可降低了Rho激酶的表達(dá)。LPS刺激和Cx43高表達(dá)可顯著升高的M

12、LC20的磷酸化水平，Rho激酶抑制劑可抑制MLC20磷酸化升高。Cx43的高表達(dá)可上調(diào)Rho激酶蛋白表達(dá)水平。提示Rho激酶-MLC20通路參與了Cx43對(duì)休克血管滲漏的調(diào)節(jié)
　?。ㄈ㎡PN/緊密連接蛋白在Cx43調(diào)節(jié)血管滲漏中的作用及機(jī)制研究
　　嚴(yán)重膿毒癥大鼠和LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，OPN的表達(dá)顯著升高，zo-1和claudin-5的表達(dá)逐漸降低。Cx43高表達(dá)顯著性地降低了zo-1和claudin-5的表達(dá)。Cx4

13、3干擾對(duì)zo-1和claudin-5的表達(dá)沒影響，但能阻止LPS刺激引起的zo-1和claudin-5表達(dá)的下降。OPN干擾可抑制Cx43對(duì)zo-1和claudin-5表達(dá)的下調(diào)。提示，OPN介導(dǎo)了Cx43對(duì)休克血管滲漏的調(diào)節(jié)。Cx43高表達(dá)顯著性地升高了Tcf-4和β-catenin的mRNA水平及上調(diào)了OPN的表達(dá)，β-catenin和Tcf-4的RNA干擾可抑制Cx43對(duì)OPN表達(dá)的上調(diào)。證實(shí)了Cx43對(duì)OPN的調(diào)節(jié)是通過轉(zhuǎn)錄因子

14、Tcf-4/β-catenin來實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分 Cx43調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性及其機(jī)制
　?。ㄒ唬〤x43介導(dǎo)PDGF調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性及與PKC和Rho激酶的關(guān)系
　　PDGF可明顯改善休克后血管的反應(yīng)性，MEGJ的阻斷劑18-GA和Cx43AODN抑制了PDGF對(duì)休克血管反應(yīng)性的改善作用。PKC抑制劑和Rho激酶抑制劑可顯著抑制PDGF對(duì)休克血管反應(yīng)性和鈣敏感性的的改善作用。PDGF可明顯升高缺氧血管中R

15、ho激酶底物MYPT和PKC底物PeptagC1的磷酸化，Cx43AODN明顯抑制了PDGF對(duì)缺氧血管MYPT和PeptagC1的磷酸化改善作用。提示Cx43通過激活PKC和Rho激酶通路，介導(dǎo)了PDGF對(duì)休克血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)。
　?。ǘ〤x43在BK調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性中的作用及機(jī)制
　　BK顯著改善休克后血管的反應(yīng)性，MEGJ阻斷劑18-GA和Cx43AODN顯著性的降低了血管對(duì)BK的反應(yīng)性。BK可磷酸化Cx43的ser36

16、8位點(diǎn)及激活Rho激酶，PKC-α和PKC-ε的活性，BK對(duì)休克血管的改善作用可被Rho激酶抑制劑和PKC抑制劑所阻斷。PKC和Rho激酶的激動(dòng)劑可改善休克血管對(duì)BK的反應(yīng)性，這種作用可被Cx43AODN所阻斷。提示，Cx43通過其ser368位點(diǎn)磷酸化和PKC，Rho激酶通路，參與了BK對(duì)休克血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論：
　　1.Cx43參與了休克后血管通透性的調(diào)節(jié)，一方面Cx43通過激活Rock1-MLC20通路，使細(xì)