Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制.pdf

1、膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)，可引起嚴(yán)重的器官功能衰竭，其發(fā)病率和死亡率均很高，嚴(yán)重威脅人類生命健康。血管通透性增加是膿毒癥重要的病理生理過程，是導(dǎo)致器官功能損傷的重要原因之一。關(guān)于膿毒癥血管通透性的機(jī)制與防治有大量研究，并在臨床取得一定的效果，但還有待進(jìn)一步闡明。
　　水通道蛋白(Aquaporin，Aqp)是一種能介導(dǎo)水快速進(jìn)出細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在大鼠體內(nèi)有12種亞型，各亞型在各器官表達(dá)和功能不一。研究發(fā)現(xiàn)Aqp除作為通道

2、調(diào)節(jié)水和甘油及其他小分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞外，還能作為細(xì)胞信號分子介導(dǎo)細(xì)胞的遷移、分化、分泌等功能。目前研究發(fā)現(xiàn)Aqps在腦缺血缺氧再灌注損傷、腫瘤、腎病、視網(wǎng)膜損傷及干燥綜合癥等多種疾病的病理生理過程發(fā)揮著重要作用。同時研究發(fā)現(xiàn)Aqps在與血管通透性相關(guān)疾病也發(fā)揮作用。Aqps是否參與膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)及哪種Aqp在其中起主要作用目前不清楚。
　　據(jù)此，本課題采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型，研究(1)Aqp3在膿毒癥肺血管通

3、透性的作用;(2)Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)機(jī)制;(3)SS-31通過Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護(hù)作用。
　　方法:
　　采用盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型，提取大鼠原代肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;提取肺靜脈和內(nèi)皮細(xì)胞RNA和總蛋白;使用PCR的方法檢測肺靜脈中Aqp3的表達(dá)變化;使用蛋白免疫印跡檢測肺靜脈和內(nèi)皮細(xì)胞Aqp3、Cav-1、Occludin蛋白變化;異硫氰酸熒光素標(biāo)記的熒光白蛋白透過來檢測肺血管及內(nèi)皮細(xì)胞的通透性

4、;ROS試劑盒測肺靜脈和內(nèi)皮細(xì)胞ROS變化;使用小RNA對Aqp3的表達(dá)進(jìn)行干擾。
　　內(nèi)容:
　　第一部分 Aqp3在膿毒癥肺血管通透性的作用
　　1.采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型，取正常和膿毒癥大鼠肺靜脈，提取各組肺靜脈組織RNA，測各種水通道蛋白RNA的表達(dá)變化。在動物水平通過多批次實驗證明，Aqp的12個亞型在膿毒癥肺血管的表達(dá)大多增強(qiáng)，其中Aqp3的增強(qiáng)趨勢更明顯。因此猜測Aqp3在膿毒癥肺血管通透性中

5、起重要作用。
　　2.在動物水平，采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型，測膿毒癥6h和膿毒癥12h和假手術(shù)組大鼠肺血管通透性變化，同時提取各組大鼠肺靜脈，檢測肺靜脈中Aqp3的表達(dá)變化，初步了解膿毒癥大鼠肺血管通透性的變化和Aqp3表達(dá)變化的關(guān)系。在細(xì)胞水平，提取原代肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，使用LPS(1μg/ml)分別作用肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6h和12h，觀察LPS刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化和Aqp3的表達(dá)變化，進(jìn)一步了解LPS刺激肺靜脈內(nèi)皮細(xì)

6、胞后通透性變化和內(nèi)皮細(xì)胞Aqp3表達(dá)變化的關(guān)系。另外，在細(xì)胞水平，提取原代內(nèi)皮細(xì)胞，采用小RNA干擾Aqp3，觀察LPS引起的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化，明確Aqp3在膿毒癥肺血管通透性中的作用。
　　第二部分 Aqp3調(diào)節(jié)膿毒癥肺血管通透性的機(jī)制
　　在動物水平上，采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型，提取膿毒癥6h、12h組和假手術(shù)組大鼠肺靜脈，測肺靜脈中影響穿細(xì)胞途徑蛋白Cav-1和細(xì)胞旁途徑緊密連接蛋白Occludin的

7、表達(dá)變化。在細(xì)胞水平上，提取原代肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，使用LPS(1μg/ml)作用肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6h和12h，測LPS作用不同時間的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1和Occludin的表達(dá)。同時，在細(xì)胞水平，提取原代內(nèi)皮細(xì)胞，使用小RNA干擾Aqp3，測LPS作用的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1和Occludin的表達(dá)。
　　第三部分 SS-31通過Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護(hù)作用
　　在動物水平，采用盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型，在模型

8、結(jié)束后經(jīng)尾靜脈注射不同劑量的SS-31(0.5mg/kg，1mg/kg，3mg/kg)，觀察給藥后的肺血管通透性變化;另外，復(fù)制膿毒癥模型，模型結(jié)束后尾靜脈注射SS-31(3mg/kg)，對照組尾靜脈注射生理鹽水，取模型組和對照組大鼠肺靜脈，測Aqp3表達(dá)和ROS的變化，驗證SS-31通過調(diào)節(jié)Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護(hù)作用。在細(xì)胞水平，提取原代肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，使用SS-31(0.1μg/ml)預(yù)處理細(xì)胞，觀察LPS(1μg/ml

9、)作用后測內(nèi)皮細(xì)胞通透性和Aqp3的表達(dá)及ROS的變化，驗證SS-31通過Aqp3對LPS刺激的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分 Aqp3在膿毒癥肺血管通透性作用
　　1.膿毒癥大鼠肺靜脈中多種Aqps的RNA表達(dá)增強(qiáng)，包括Aqp1，3，4，7，11，12，其中Aqp3增強(qiáng)趨勢最明顯。在動物水平隨著膿毒癥時間的延長肺血管通透性和Aqp3的表達(dá)增強(qiáng)越明顯，膿毒癥6h和12h組較假手術(shù)組肺血管通透性和A

10、qp3的蛋白表達(dá)明顯升高，Aqp3的表達(dá)和通透性的變化一致;在細(xì)胞水平LPS刺激6h和12h肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增加，Aqp3的蛋白表達(dá)也明顯升高。
　　2.在細(xì)胞水平干擾Aqp3能有效拮抗LPS刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高。
　　第二部分 Aqp3在膿毒癥肺血管通透性機(jī)制
　　1.膿毒癥后影響跨細(xì)胞途徑蛋白Cav-1表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞旁途徑緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)減弱。LPS刺激后肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1表

11、達(dá)增強(qiáng)，Occludin的表達(dá)減弱，與動物水平上變化一致。
　　2.細(xì)胞水平上干擾Aqp3后能拮抗LPS刺激肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1增強(qiáng)和Occludin的減弱。
　　第三部分 SS-31通過Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護(hù)作用
　　1.膿毒癥后大鼠肺靜脈ROS表達(dá)增加，SS-31預(yù)處理能拮抗膿毒癥ROS的增加;同時SS-31預(yù)處理膿毒癥大鼠能拮抗膿毒癥肺血管通透性的增加和Aqp3表達(dá)增強(qiáng)。
　　2.LPS刺激

12、后肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS表達(dá)增加，SS-31預(yù)處理拮抗LPS刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞ROS的升高;同時SS-31預(yù)處理LPS刺激的肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能拮抗內(nèi)皮細(xì)胞通透性和Aqp3表達(dá)的增強(qiáng)，與動物水平一致。
　　3.SS-31預(yù)處理后能改善膿毒癥大鼠存活率和存活時間。
　　結(jié)論:
　　1.Aqp3對膿毒癥肺血管通透性起調(diào)節(jié)作用;
　　2.Aqp3參與膿毒癥肺血管通透性的調(diào)節(jié)可能通過穿細(xì)胞和跨細(xì)胞途徑;
　　3.SS-3