抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病小鼠下肢缺血的治療研究.pdf

1、目的:研究在糖尿病小鼠的下肢缺血模型中，抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)缺血下肢血流的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:1.糖尿病小鼠的喂養(yǎng):給予普通C57/BL6小鼠高脂高糖飼料，喂養(yǎng)14周，測(cè)定其血糖值。2.下肢缺血模型的建立:將小鼠麻醉后，結(jié)扎其左下肢股動(dòng)脈，并且在雙結(jié)之間離斷股動(dòng)脈干支，復(fù)溫后，應(yīng)用激光多普勒掃描儀對(duì)小鼠雙下肢血流進(jìn)行掃描，記錄其血流灌注恢復(fù)情況。在結(jié)扎前和結(jié)扎后(1d)、3d、7d、11d、14d對(duì)小鼠雙下肢進(jìn)行掃描并記

2、錄其血流恢復(fù)情況。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為四組，糖尿病小鼠對(duì)照組、糖尿病小鼠貝伐單抗（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑）組、普通C57/BL6小鼠對(duì)照組和普通C57/BL6小鼠貝伐單抗組。各組均為18只小鼠，小鼠經(jīng)腹腔注射貝伐單抗或生理鹽水，在結(jié)扎后(1d)，3d，7d，11d各給予等量的貝伐單抗或生理鹽水一次，在第13天時(shí)，尾靜脈注射檢測(cè)血管滲漏的熒光染料，利用小動(dòng)物活體成像儀監(jiān)測(cè)小鼠的血管滲漏情況。在第3、7、14d時(shí)，各組分別處死6只實(shí)驗(yàn)小鼠，取小鼠

3、下肢雙側(cè)腓腸肌。3.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)待測(cè)組織樣品中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(Vascularendothelial growth factor-A; VEGF-A)的含量:取實(shí)驗(yàn)小鼠腓腸肌，液氮研磨肌肉組織并加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑制備成蛋白原液，然后根據(jù)蛋白質(zhì)印跡法的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測(cè)肌肉組織中VEGF蛋白的表達(dá)量。4.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immu no sorbent assay; ELISA)法對(duì)

4、待測(cè)組織樣品中VEGF-A、血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(Platelet derived growth factor-BB;PDGF-BB)的含量進(jìn)行檢測(cè):按照mouse-PDGF-BB、mouse-VEGF-A ELISA試劑盒操作方法對(duì)小鼠腓腸肌樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其VEGF-A、PDGF-BB的含量。5.RT-PCR分析待測(cè)組織中PDGF-BB的表達(dá):按照提取總RNA的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)組織進(jìn)行研磨、裂解及提取，然后將提取得到的總RNA逆轉(zhuǎn)錄

5、為cDNA。最后利用RT-PCR儀分析其目的基因PDGF-BB的表達(dá)水平。6.免疫熒光法分析小鼠下肢雙側(cè)腓腸肌血管新生及成熟情況:取小鼠下肢腓腸肌，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成病理切片，用anti-PECAM-1、anti-NG-2標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及周細(xì)胞，對(duì)熒光標(biāo)記進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算血管新生及周細(xì)胞覆蓋程度。7.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)貝伐單抗誘導(dǎo)細(xì)胞分泌PDGF-BB的水平:將人臍靜脈血管內(nèi)皮肌細(xì)胞(Human umbi

6、lical vein endothelium cell; HUVEC)分別培養(yǎng)于四個(gè)培養(yǎng)皿中，分為4個(gè)小組，分別為空白組、貝伐單抗組、VEGF組、貝伐單抗+VEGF組，在無(wú)血清培養(yǎng)基情況下，向各組中加入對(duì)應(yīng)刺激因子，培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞做ELISA實(shí)驗(yàn)。8.統(tǒng)計(jì)方法:采用spss17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.貝伐單抗對(duì)小鼠缺血下肢血流恢復(fù)的影響:各組小鼠腓腸肌處血流恢復(fù)有較大

7、差異，其中，給予貝伐單抗的糖尿病小鼠組血流恢復(fù)情況優(yōu)于給予生理鹽水的糖尿病小鼠組。2.蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，給予貝伐單抗的糖尿病小鼠組的VEGF蛋白量低于糖尿病小鼠對(duì)照組的VEGF蛋白量。3.待測(cè)樣品ELISA結(jié)果顯示，糖尿病小鼠對(duì)照組缺血側(cè)腓腸肌中VEGF-A的蛋白水平明顯高于同時(shí)間點(diǎn)的糖尿病小鼠貝伐單抗組VEGF-A的蛋白水平。在第7天時(shí)，糖尿病小鼠對(duì)照組的VEGF蛋白水平最高。隨著時(shí)間的推移，貝伐單抗組的PDGF-BB蛋白含量逐漸升高，

8、并且在第7、14天時(shí)，糖尿病小鼠貝伐單抗組的PDGF-BB蛋白水平均高于同時(shí)間點(diǎn)糖尿病小鼠對(duì)照組的PDGF-BB蛋白水平。4.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與其他組相比，貝伐單抗刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PDGF-BB無(wú)明顯差異。5.RT-PCR結(jié)果顯示，糖尿病貝伐單抗組小鼠缺血側(cè)中PDGF-BB的表達(dá)量高于糖尿病對(duì)照組小鼠缺血側(cè)PDGF-BB的表達(dá)量。6.小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示:在第14天時(shí)，糖尿病小鼠貝伐單抗組的血管滲漏程度明顯低于糖尿病小