糖原合成酶激酶3β在肝功能衰竭的變化與意義.pdf

1、目的：肝功能衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損害，是臨床常見的嚴重肝病癥候群，病死率極高。多年來，各國學者對肝衰竭的發(fā)病機制不斷進行探索，目前尚未完全闡明。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β,GSK3β）為糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase3,GSK3）的亞型。最新研究證實，GSK3參與炎癥的進程，其中GSK3β影響轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。本研究旨在通過檢測GSK3β在

2、肝衰竭的表達，探討GSK3β對肝衰竭病情演變的影響。
　　方法：
　　1.動物實驗
　　通過D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）腹腔注射構(gòu)建小鼠急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）模型。檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate transam inase,AST)、總膽紅素(Total bi

3、lirubin,TB)、凝血酶原時間(Prothrombintime,PT)水平；部分肝組織石蠟包埋后切片，用于蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色觀察肝臟病理變化；余肝組織經(jīng)液氮速凍后，-80℃冰箱保存，用于實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)檢測肝組織GSK3β mRNA表達，免疫組織化學染色法檢測肝組織GSK3β、p-GSK3β的表達及分布，Western

4、 blot檢測肝組織 GSK3β、p-GSK3β的表達。ˉ
　　2.臨床實驗
　　選取2015年1月至2015年10月河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院門診或
　　住院患者，共47例，其中慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者22例（CHB組）、HBV相關慢加急性肝功能衰竭（Acute on chronic liver failure,ACLF）患者25例（ACLF組），另外同期于河北醫(yī)科大學第三醫(yī)

5、院體檢中心選取20例健康體檢者作為健康對照(Healthy control)組。除此之外，收集接受肝移植的ACLF患者肝組織12例、肝組織活檢的CHB患者肝組織23例及正常供體肝組織4例。檢測入組患者血清ALT、AST、TB、DB、INR、HBV DNA水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）檢測患者血清p-GSK3β、TNFα水平；RT-PCR檢測肝組織GSK3β mRN

6、A表達；免疫組織化學染色法檢測肝組織 GSK3β、p-GSK3β表達及分布；Western blot檢測肝組織 GSK3β、p-GSK3β的表達。ˉ
　　結(jié)果：
　　1.動物實驗部分
　　1.1 成功構(gòu)建小鼠肝衰竭模型
　　實驗結(jié)果可見正常對照組小鼠毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)好，飲食量多；肝衰竭組小鼠毛發(fā)凌亂沒有光澤，飲食量、活動減少，精神欠佳，反應遲鈍。
　　1.2 小鼠血清生化指標
　　肝衰竭組小鼠血清

7、ALT、AST、TB、PT水平高于正常對照組（P均<0.01）。
　　1.3 肝組織病理學改變
　　正常對照組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，以中央靜脈為軸，肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，無變性及壞死，無炎細胞浸潤；肝衰竭組：肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞索消失，可見多處出血壞死灶，壞死灶可見細胞核的碎裂及壞死并有大量炎細胞浸潤。
　　1.4 肝組織GSK3βmRNA的表達
　　肝衰組小鼠肝組織GSK3β mRNA表

8、達水平較正常對照組明顯升高（P<0.01）。
　　1.5 肝組織GSK3β、p-GSK3β的分布與表達
　　免疫組織化學染色結(jié)果顯示：GSK3β、p-GSK3β主要表達于肝細胞胞漿。Western blot結(jié)果顯示：正常對照組、ALF組小鼠肝組織GSK3β表達水平無明顯差異（P>0.05）；ALF組小鼠肝組織p-GSK3β蛋白表達較正常對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2.臨床實驗部分
　

9、　2.1 各組研究對象年齡及性別比例具有可比性。ACLF組患者血清ALT、TB、DB、INR水平明顯高于CHB組及健康對照組（P<0.01）；ACLF組患者Alb則明顯低于CHB組及健康對照組（P<0.01）；ACLF組和CHB組AST水平、HBV DNA載量無明顯差異（P>0.05）。
　　2.2 血清TNFα與p-GSK3β水平
　　CHB組血清TNFα水平較正常對照組升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；ACLF組

10、TNFα水平較正常對照組、CHB組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　CHB組血清p-GSK3β水平較正常對照組降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；ACLF組p-GSK3β水平較正常對照組、CHB組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2.3 肝組織GSK3βmRNA的表達
　　CHB組GSK3βmRNA表達水平較正常對照組無明顯差異（P>0.05）；ACLF組 GSK3β mRNA

11、表達水平較正常對照組、CHB組明顯升高（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2.4 肝組織GSK3β、p-GSK3β的分布與表達
　　免疫組織化學染色結(jié)果顯示：GSK3β、p-GSK3β主要表達于肝細胞胞漿。蛋白印跡法結(jié)果顯示：正常對照組、CHB組、ACLF組患者肝組織GSK3β表達水平無明顯差異（P>0.05）；CHB組p-GSK3β表達水平較正常對照組降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；ACLF組 p-GSK

12、3β表達水平較正常對照組、CHB組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2.5 ACLF患者血清p-GSK3β與TNFα相關性分析
　　ACLF患者血清p-GSK3β與TNFα呈負相關，相關系數(shù)為r=-0.761（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.GSK3β通過調(diào)節(jié)磷酸化/去磷酸化水平參與了肝衰竭的病理生理過程。
　　2.HBV相關ACLF患者GSK3β活性增強，TNFα表達升高，提示GS