CX-GJIC在急性肝功能衰竭大鼠肝臟中的變化與意義.pdf

1、目的研究大鼠肝臟CX／GJIC在急性肝功能衰竭(AHF)不同階段的變化規(guī)律；探討嚴(yán)重肝損傷時CX／GJIC的變化對肝損傷修復(fù)的調(diào)控以及三七皂甙在肝損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制。@方法 選擇雄性Wistar大鼠260只(SPF級，由江西省實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量檢測中心提供)，體重180～200克。所有動物先行適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)抽取其中的60只作為苯巴比妥組(PB組，n=60)，用800PPM濃度的苯巴比妥行預(yù)處理喂養(yǎng)一周。其余200只隨機(jī)分成三組

2、：對照組(n=30)，模型組(n=100)，三七皂甙組(PNS組，n=70)。PB組動物誘導(dǎo)結(jié)束后，PB、模型和PNS三組動物同瞎開始造模，造模前三天開始四組實(shí)驗(yàn)動物(包括對照組)均予以慶大霉素及乳果糖灌胃，并持續(xù)至造模后三天。采用四氯化碳腹腔注射法建立AHF模型，分別在造模后1、3、7、l0、l4天5個時間點(diǎn)開腹抽取下腔靜脈血標(biāo)本查血生化(ALT)，采取肝組織標(biāo)本行HE、免疫組織化學(xué)檢查Cx 3 2蛋白、切開標(biāo)記熒光染料傳輸(IL／D

3、T)查GHC功能和RT-PCR檢查Cx32 mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 1.造模后動物立即出現(xiàn)精神萎靡，活動及攝食減少，嗜睡，毛色晦暗，腹脹，尿色黃，行動減慢，嚴(yán)重者可伴有全身多臟器出血，抽搐，昏迷甚至死亡。PB組與模型組(P<0.01)，PNS與模型組(P<0.05)的組間病死率差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明PB和PNS都可以降低AHF模型動物的病死率。2.大體標(biāo)本上可見三組動物在造模后第一天的肝臟組織呈現(xiàn)黃褐色或暗紅色，質(zhì)地

4、松脆，如豆腐渣樣，但PB組與PNS組動物的肝臟外觀要略好于模型組。三天后開始好轉(zhuǎn)，但好轉(zhuǎn)后的肝臟與正常肝臟在外形及體積上仍存在差別，主要表現(xiàn)為肝臟增大，邊緣變鈍，顏色變深。后期，模型組及PNS組恢復(fù)至基本正常肝臟顏色、外形及體積，但PB組的肝臟組織明顯增大并呈現(xiàn)一定的瘤型轉(zhuǎn)變傾向，表現(xiàn)為肝臟質(zhì)地偏硬，切開時感覺較韌。HE切片示：對照組肝細(xì)胞正常排列，肝竇存在，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞內(nèi)未見異常物質(zhì)出現(xiàn)或正常物質(zhì)的過多積聚；進(jìn)入模型的各組動物的

5、肝臟組織病理切片顯示肝細(xì)胞的壞死均超過70％以上，損傷以中央靜脈周圍明顯，隨病程發(fā)展，程度不同的波及小葉周邊肝細(xì)胞，符合四氯化碳所致之AHF模型的典型鏡下表現(xiàn)。模型組肝細(xì)胞的損害以損傷后一天時最為明顯，以后逐步恢復(fù)，但到后期在HE切片上仍顯示出比較明顯的空泡變性現(xiàn)象，在實(shí)驗(yàn)過程中未能見到完全正常之病理征象，顯示模型組動物的肝臟組織的完全恢復(fù)需要更長時間；PB組肝細(xì)胞腫脹明顯，部分玻璃樣變，損傷在3天時最為明顯，以后逐步恢復(fù)，各時間點(diǎn)的病

6、理切片顯示損傷部位主要局限在中央靜脈周圍，小葉周邊的肝細(xì)胞損傷較輕，但到后期出現(xiàn)類似假小葉樣改變；PNS組動物的肝組織表現(xiàn)早期損傷程度較其它各組輕，中后期恢復(fù)快，到第十天時已基本恢復(fù)正常；3．生化結(jié)果顯示，在造模后的第一天，三組動物的ALT指標(biāo)全部升高，符合AHF的轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)，但組間存在差別，以模型組為甚，PB組與PNS組相仿，第三天，PB組ALT進(jìn)一步升高，而模型組和PNS組開始降低，到第七天各組動物的ALT已基本正常。4．對組織進(jìn)行

7、熒光染料傳輸?shù)脑囼?yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組的染料傳輸能力在造模后與對照組比明顯減低(P<0.01)，這種情況在第三天達(dá)到最低程度，此后雖然逐漸恢復(fù)，但到第十四天仍與對照組間差別有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證實(shí)在該時間點(diǎn)其GJIC功能仍未能恢復(fù)正常；進(jìn)行了PB誘導(dǎo)的動物其染料傳輸明顯受到抑制，除在第二個時間點(diǎn)與模型組間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其余時間點(diǎn)與其它各組間差別均有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PNS組的染料傳輸

8、在造模后第一天與對照組相比明顯減低(P<0.01)，其程度與模型組相仿(P>0.05)，但與模型組在第三天時出現(xiàn)縫隙連接通訊能力下降不同的是，PNS組從第三天始由熒光染料傳輸所反映的GJIC功能即開始恢復(fù)，與模型組相比差別有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，直到第十四天恢復(fù)正常，與對照組間差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5．Cx 32抗體的免疫組化顯示，模型組的Cx 32蛋白主要集中在胞膜上，細(xì)胞間，數(shù)量較PB組明顯增加，且隨著時

9、間的推移，數(shù)量呈進(jìn)行性增加的趨勢；PB組的Cx32主要分布在胞漿內(nèi)，而且數(shù)量極少，在造模成功后七天達(dá)到最高點(diǎn)后，又開始下降并維持在一較低水平；PNS組的蛋白分布及數(shù)量與模型組類似。6．通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)各組標(biāo)本的Cx32 mRNA的表達(dá)，在PB組持續(xù)較低，在何時間點(diǎn)與其它組間差別有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而模型組與PNS組其表達(dá)始終相仿(P＞0.05)。 結(jié)論：1．本研究采用的乳果糖+慶大霉素灌胃和四氯化碳+橄欖油