玻璃體腔移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　觀察由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)體外誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)經(jīng)玻璃體腔途徑移植到糖尿病大鼠眼內(nèi)后，視網(wǎng)膜內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達(dá)的變化和胸腺肽-1(thymosin-1,Thy-1)陽性表達(dá)的視網(wǎng)膜神經(jīng)

2、節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)的變化情況，探討璃體腔移植hUCMSCs誘導(dǎo)的NSCs在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的可能神經(jīng)保護(hù)作用，為DR的臨床防治提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　方法；
　　采用神經(jīng)分化培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)hUCMSCs向NSCs定向轉(zhuǎn)化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。免疫熒光染色檢測NSCs標(biāo)志物巢蛋白和神經(jīng)源性分化因子1(neurogenic

3、differentiation factor1, NeuroD1)表達(dá)情況。成年雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley, SD)大鼠52只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(A組)和糖尿病組。鏈尿佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型。造模后1個(gè)月，將糖尿病組大鼠隨機(jī)分為DR對照組(B組)，玻璃體腔注射hUCMSCs組(C組)，玻璃體腔注射hUCMSCs誘導(dǎo)的NSCs組(D組)。各組均為13只

4、大鼠。干預(yù)后2、4、6、8周，免疫組織化學(xué)染色觀察視網(wǎng)膜BDNF及Thy-1陽性染色情況，Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析視網(wǎng)膜陽性染色區(qū)的平均累積光密度值(integrated optic density, IOD)，并對Thy-1陽性染色的RGCs計(jì)數(shù)。SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. hUCMSCs在神經(jīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)3天時(shí)，60-70％細(xì)

5、胞開始聚集形成大小不等的細(xì)胞簇，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，逐漸形成懸浮的細(xì)胞團(tuán)并增大、增多。
　　2.免疫熒光染色示20天時(shí)誘導(dǎo)的hUCMSCs高表達(dá)NSCs的特異性標(biāo)志巢蛋白和NeuroD1，陽性細(xì)胞表達(dá)量分別占87.3%和72.6%。
　　3.糖尿病大鼠成模38只，成模率97.43%。本實(shí)驗(yàn)共有26只大鼠行玻璃體腔注射，其中2只大鼠發(fā)生玻璃體腔出血，最終各組大鼠均為12只納入研究。
　　4.免疫組織化學(xué)染色示：(1) B

6、DNF：A組大鼠視網(wǎng)膜BDNF表達(dá)陽性，各層均有表達(dá)。B組呈弱陽性表達(dá)，隨干預(yù)后時(shí)間延長，染色強(qiáng)度呈減弱趨勢。C組、D組染色強(qiáng)度隨干預(yù)后時(shí)間延長而增強(qiáng)，D組染色較同期B組、C組更深。B組BDNF表達(dá)隨時(shí)間逐漸減少，C組、D組BDNF表達(dá)隨時(shí)間逐漸增加，D組更為明顯，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有顯著性(F=20.325、13.540、16.896， P=0.000)。除干預(yù)后2周時(shí)C組較B組BDNF表達(dá)無明顯變化，余各時(shí)間點(diǎn)各組間 BDNF

7、表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.144、27.419、83.659、89.654， P=0.000)。(2) Thy-1：A組 Thy-1呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglioncelllayer，GCL)和內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)層。B組染色強(qiáng)度明顯減弱，且隨干預(yù)后時(shí)間延長染色強(qiáng)度逐漸降低。C、D組隨干預(yù)后時(shí)間延長其染色深度逐漸增強(qiáng)，D組染色更深。B組Thy-1表達(dá)隨時(shí)間逐漸減少，C

8、組、D組Thy-1表達(dá)隨時(shí)間逐漸增加，D組更為明顯，除B組、D組干預(yù)后6周較8周 Thy-1表達(dá)無明顯改變，余組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有顯著性(F=16.087、15.239、10.950，P=0.000)。除干預(yù)后2周時(shí)C組較B組Thy-1表達(dá)無明顯變化，余各時(shí)間點(diǎn)各組間Thy-1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.463、51.360、61.820、101.597，P=0.000)。(3) RGCs計(jì)數(shù)：A組大鼠視網(wǎng)膜Thy-1陽性R

9、GCs數(shù)目每高倍鏡視野(×400)約33個(gè)，B組RGCs數(shù)隨時(shí)間逐漸減少，C組、D組隨時(shí)間RGCs數(shù)逐漸增多，D組大鼠更為明顯，但均低于同期A組的大鼠RGCs數(shù)目，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.273、17.606、16.290，P=0.000)。除干預(yù)后2周C組較B組RGCs無明顯差異，B組、C組、D組余各時(shí)間點(diǎn)各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=100.333、117.404、70.212、90.012，P=0.000)。

10、r>　　5. BDNF蛋白表達(dá)量與RGCs數(shù)量相關(guān)性分析結(jié)果顯示BDNF的平均IOD值與RGCs數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.964，P=0.000)。
　　結(jié)論：
　　1.體外hUCMSCs能夠定向誘導(dǎo)為NSCs，并高表達(dá)NSCs標(biāo)志物巢蛋白和NeuroD1。
　　2. STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠6周時(shí)已經(jīng)存在RGCs的丟失。hUCMSCs誘導(dǎo)的NSCs經(jīng)玻璃體腔移植后能夠減少RGCs的丟失。
　　3. hUCMSCs