糖尿病大鼠玻璃體腔移植不同濃度人臍帶間充質干細胞的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 觀察玻璃體腔移植不同濃度人臍帶間充質干細胞(human umbilicalmesenchymal stem cells，hUCMSCs)后糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠視網膜功能變化及視網膜神經生長因子(nerve growth factor，NGF)的表達情況，觀察比較移植不同濃度hUCMSCs對糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)治療的療效差異，進一步證明治

2、療DR的最佳hUCMSCs濃度，探討hUCMSCs治療DR的可能機制。
　　 方法:
　　 健康成年雄性SD大鼠48只，隨機分成正常對照組（A組）和DM組，分別為10、38只。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)尾靜脈注射制作SD大鼠DR模型。將DM組大鼠隨機分為DR組（B組）、玻璃體腔注射高濃度(1*10^6～7)hUCMSCs2μL組（C組），玻璃體腔注射低濃度（1*10^5～6）hUCMSCs2μL組（D

3、組），玻璃體腔注射安慰劑2μL組（E組）。正常對照組（A組，10只）和B組無處理。成模后每2-4w進行血糖監(jiān)測。用溴化乙錠(Evans blue，EB)染色視網膜鋪片，熒光顯微鏡觀察視網膜血管的變化情況:蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察視網膜形態(tài)學變化;免疫組織化學法觀察視網膜NGF陽性染色的情況，Image-Pro Plus6.0圖像處理分析軟件分析各組染色區(qū)的平均累積光密度(integrated optic density

4、，IOD);用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測視網膜中NGF mRNA的相對表達量。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，組間數據比較采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.血糖水平監(jiān)測:STZ尾靜脈注射一周后，測得正常對照組大鼠平均血糖值為（5.43±0.81）mmol/L，糖尿病組大鼠血糖值為（27.59±3.56）mmol/L。在不

5、同時間點測得DM大鼠血糖水平較高，但基本保持在一個穩(wěn)定水平;與同期正常對照組大鼠相比差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。
　　 2.體質量監(jiān)測:大鼠造模成功時體質量于正常對照組大鼠相似，二者比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.805，P=0.433)。造模成功后正常對照組大鼠隨著周齡的增加體質量增長較快，DM大鼠體質量增長速度較正常對照組減緩，周齡越長，體質量相差越大，不同時間點測得兩組體質量差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01)。<

6、br>　　 3.EB染色視網膜鋪片:A組正常大鼠視網膜血管走形良好，血管管壁平滑，視網膜淺層大血管及深層血管網均清晰可見，未見視網膜微血管瘤和視網膜新生血管形成。DM大鼠視網膜血管走形迂曲、擴張，視網膜上可見微動脈瘤，血管呈串珠樣改變，血管周圍可見高熒光滲漏及周邊視網膜可見大片無灌注區(qū)。
　　 4.HE染色:A組正常大鼠視網膜各層結構整齊分明，細胞形態(tài)基本正常。內界膜完整清晰;神經纖維層(nerve fiber layer，N

7、FL)較稀疏呈水平排列;神經節(jié)細胞層(ganglion cell layer，GCL)排列整齊，胞核較大，呈圓形或橢圓形，染色較淡;內叢狀層(inner plexiform layer，IPL)較厚，呈較明顯的網狀結構;內核層（inner nuclear layer，INL）細胞胞核較大，染色稍深;外從狀層(outerplexiform layer，OPL)比內從狀層偏薄;外核層(outer nuclear layer，ONL)由多層細

8、胞排列組成，染色深排列緊密;光感受器細胞層(photoreceptor cell layer，PRL)內外節(jié)形態(tài)規(guī)整。B組、E組大鼠視網膜各層細胞結構排列紊亂，節(jié)細胞等各層細胞數減少，內界膜不完整，視網膜血管內皮細胞增殖，新生血管芽呈垂直狀突破內界膜生長，出現早期新生血管(neovascularization，NV)表現。C組、D組各層細胞結構排列較紊亂，各層細胞數目相對較少，可見內界膜局部不完整。
　　 5.免疫組織化學染色:

9、A組:NGF表達呈陽性，陽性細胞邊界較清晰，主要位于視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)層，IPL、OPL、外界膜、色素上皮層，INL和ONL僅有少量表達。B、E組:2W時NGF表達呈陽性，各層表達量增加，陽性著色較深。4W時NGF陽性表達開始減弱，各層表達量減少。8W時NGF陽性表達顯著減少，各層陽性染色均較淺。C、D組:2W時NGF表達增多，隨著時間的推移，NGF陽性表達逐漸增強，8W時達到高峰

10、，C組更為明顯，染色更深。
　　 6.RT-PCR檢測視網膜NGF mRNA的相對表達量:2w時4個DR組間視網膜NGF mRNA表達差異無顯著性(F=0.163，P=0.920)，其他時間點相比差異均具有顯著性（F=13.737，25.060，123.277，P均為0.000）。4w、6w、8w時B組與E組NGF mRAN相比差異無顯著性(P=0.703，P=0.801，P=0.819)，與C組、D組相比差異具有顯著性(P＜0

11、.05)。4w、6w時C組、D組相比差異無顯著性(P=0.542，0.801)，8w時C組與D組相比差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.STZ誘導的DM大鼠，是模擬糖尿病視網膜病變的一種可靠的動物模型;
　　 2.DR早期即會對視網膜各層細胞造成損傷;
　　 3.DR早期引起NGF的表達升高，隨著時間的推移NGF表達呈下降趨勢，視網膜神經功能減退;
　　 4.玻璃體腔注射hUC