骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對視神經(jīng)損傷家貓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)影響的研究.pdf

1、人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷后不能再生軸突，視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亦是如此，易導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，這種不可逆的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，是致盲的主要原因。促進(jìn)軸突的再生，預(yù)防視神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的死亡，從而恢復(fù)有效視功能是外傷性視神經(jīng)病的主要治療目的。近年來，隨著外傷性視神經(jīng)病機理的深入研究及相關(guān)實驗研究工作的不斷開展，外傷性視神經(jīng)病的治療途徑亦有多種，如周圍神經(jīng)移植；神經(jīng)營養(yǎng)因子的注射治療；以及雪旺細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、干細(xì)胞移植等已經(jīng)在

2、很多的實驗研究中進(jìn)行了報道。然而，現(xiàn)在由于資源的限制，組織移植免疫排斥反應(yīng)以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞臨時保護(hù)系統(tǒng)等諸多原因，目前有效治療神經(jīng)修復(fù)和防止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的方法還很有限。
　　近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或外傷性視神經(jīng)病方面顯示出巨大的潛力和優(yōu)勢。據(jù)報道在脊髓損傷后的動物模型中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能持續(xù)分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，這被認(rèn)為是一個軸突再生的影響機制。此外，神經(jīng)營養(yǎng)因子剝奪及缺乏已被證明是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)

3、細(xì)胞凋亡的主要原因。以前的研究已經(jīng)表明神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等等，具有營養(yǎng)成熟神經(jīng)元的作用，并且能夠參與損傷神經(jīng)的再生及其功能的恢復(fù)。作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生具有深刻的影響，并且有利于神經(jīng)元之間的突觸連接。視神經(jīng)損傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)及延遲視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用如何呢？是否是通過分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因

4、子來實現(xiàn)仍然是未知的。
　　本研究旨在探討玻璃體腔內(nèi)注射移植體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能否增加視神經(jīng)損傷后家貓的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)量，及其可能的潛在增長機制，希望通過研究為視神經(jīng)受損傷后的有效修復(fù)治療提供新的思路和方法。本課題主要分為以下三個部分分別進(jìn)行基礎(chǔ)研究和觀察。
　　第一部分 貓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)、純化、鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)、純化家貓的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對獲得細(xì)胞的表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，為

5、進(jìn)一步利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療視神經(jīng)損傷家貓的的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：利用全骨髓貼壁法對家貓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)、純化；通過間斷更換培養(yǎng)液獲得較純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察；根據(jù)第1、3、5、7、9代細(xì)胞的鏡下增殖情況繪制出生長曲線；通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD34、CD44和CD90的表達(dá)率。
　　結(jié)果：在倒置相差顯微鏡下觀察，分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁呈梭

6、形或紡錘形；原代細(xì)胞生長叢集成片，5～7d達(dá)到融合，進(jìn)行傳代；培養(yǎng)到第三代以后，細(xì)胞出現(xiàn)相對均勻的梭形扁平外觀，迅速增殖的細(xì)胞呈渦流樣排列；第3、5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力強于第7、9代；采用流式細(xì)胞儀分析鑒定表明，細(xì)胞的CD34、CD44和CD90陽性率分別為17.5％、97.9%和91%，這與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的表達(dá)一致。
　　結(jié)論：分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性，培養(yǎng)所得細(xì)胞就是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其成分相對單

7、一。第3、5代細(xì)胞純度高，增殖能力強，適合用于進(jìn)一步的實驗研究。
　　第二部分 標(biāo)準(zhǔn)化家貓外傷性視神經(jīng)損傷動物模型的建立
　　目的：利用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的視神經(jīng)夾在相同鉗夾時間下對家貓視神經(jīng)進(jìn)行損傷實驗，觀察視神經(jīng)部分損傷后家貓的閃光視覺誘發(fā)電位的變化，建立標(biāo)準(zhǔn)化的外傷性視神經(jīng)損傷家貓動物模型。
　　方法：共有10只健康的成年家貓，每只家貓的右眼為實驗眼(視神經(jīng)損傷)，左眼為對照眼（正常）。家貓的右眼損傷眼均以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的視神經(jīng)

8、夾鉗夾視神經(jīng)30秒，制成家貓視神經(jīng)部分損傷模型。在實驗眼損傷后1小時、3天、1周、2周、4周時分別進(jìn)行實驗眼和對照眼的閃光視覺誘發(fā)電位檢查，記錄主波Pl00的峰潛時和波幅，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：所有家貓正常對照眼的閃光視覺誘發(fā)電位的波形穩(wěn)定，隨時間延長均無明顯變化。損傷前實驗組與對照組主波Pl00的峰潛時、波幅兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；實驗組傷后各時間段主波Pl00的峰潛時延長及波幅降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計

9、學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：應(yīng)用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的視神經(jīng)夾可以成功建立標(biāo)準(zhǔn)化的外傷性視神經(jīng)損傷家貓動物模型。閃光視覺誘發(fā)電位檢查是確定標(biāo)準(zhǔn)化家貓外傷性視神經(jīng)損傷動物模型建立成功與否的客觀評價指標(biāo)，成功的視神經(jīng)損傷家貓動物模型表現(xiàn)為閃光視覺誘發(fā)電位主波Pl00的峰潛時延長及波幅降低。
　　第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對視神經(jīng)損傷家貓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響
　　目的：本研究旨在探討玻璃體腔內(nèi)注射移

10、植體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能否增加視神經(jīng)損傷后家貓的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)量，以及其可能的潛在作用機制。
　　方法：在外傷性視神經(jīng)損傷家貓動物模型成功建立后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組予玻璃體腔內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液組予玻璃體腔內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液。分別在移植后的3天、7天、14天及28天，用免疫熒光染色雙十八烷基四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽染色標(biāo)記法觀察分離視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率，用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試

11、驗方法檢測分離視網(wǎng)膜的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量。
　　結(jié)果：分析表明，在術(shù)后3天、7天、14天及28天，在周邊區(qū)及中央?yún)^(qū)視網(wǎng)膜上視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度均顯著減少（周邊區(qū)：P3d=0.0446,P7d=0.0011,P14d＜0.001,P28d＜0.001；中央?yún)^(qū)：P3d=0.0437,P7d=0.0067,P14d＜0.001,P28d＜0.001）。7天、14天、28天后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度顯著高于磷酸鹽緩