人臍帶間充質(zhì)干細胞對糖尿病大鼠骨折愈合的影響.pdf

1、糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由于高血糖導(dǎo)致內(nèi)分泌代謝紊亂的全身性疾病，它能夠造成包括骨骼、神經(jīng)、腎臟等多器官多系統(tǒng)損傷。糖尿病患者胰島素相對或絕對缺乏，礦物質(zhì)組織代謝紊亂。無論是臨床還是實驗研究均顯示，糖尿病能夠改變骨的生物力學(xué)性能、影響骨折的愈合。許多研究表明，糖尿病骨折愈合時間大約是非糖尿病患者的兩倍。每年雖然數(shù)以百萬計的骨折發(fā)生，大多數(shù)治愈令人滿意，但仍有5％至10％會繼續(xù)延遲愈合或不愈合，甚至導(dǎo)致假關(guān)節(jié)形

2、成或骨骼畸形，造成肢體功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活。因此如何治療糖尿病骨折日益受到人們的重視。
　　人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)和骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow MSCs，hBMSCs)一樣是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。但提取骨髓間充質(zhì)干細胞時需要有創(chuàng)操作，而且提取數(shù)量較少。另外，隨著年齡的增大，h

3、BMSCs自我更新和增殖能力降低。最近，人臍帶間充質(zhì)干細胞越來越受到人們的關(guān)注，人臍帶間充質(zhì)干細胞可以向骨、軟骨、韌帶、肌腱、肌肉及脂肪等方向分化。其來源豐富，成本較低，而且無需有創(chuàng)操作。另外，hUCMSCs免疫排斥反應(yīng)較低，無腫瘤致畸性。因此其在組織工程、干細胞移植以及基因治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，成為干細胞研究的熱點，也為我們治療糖尿病骨折愈合提供了新的思路。
　　糖尿病影響骨折愈合的原因較復(fù)雜，而細胞因子在骨折愈合過程中

4、的改變是其中重要的因素之一。其中TGF-β1和BMP-2在骨折愈合過程中具有非常重要的作用。研究表明:TGF-β1和BMP-2是骨重建和骨修復(fù)過程中重要的細胞因子。在骨折愈合過程中，TGF-β1促進間充質(zhì)干細胞和成骨細胞的增值，BMP-2是膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)化骨中非常重要的因子，其在骨折愈合過程中的研究較多，但是在糖尿病骨折愈合過程中的TGF-β1和BMP-2的變化研究相對較少。應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細胞治療糖尿病骨折愈合研究更少。
　

5、　我們應(yīng)用大鼠制作糖尿病骨折動物模型，研究糖尿病骨折愈合過程中TGF-β1和BMP-2的變化。并應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細胞，誘導(dǎo)分化為成骨細胞，然后移植到骨折部位，觀察糖尿病骨折愈合過程中TGF-β1和BMP-2的變化。為其臨床治療糖尿病骨折提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及成骨分化。
　　2.糖尿病對骨折愈合的影響及TGF-β1和BMP-2在骨折愈合過程中的變化。
　　3.人臍帶間充質(zhì)干

6、細胞注射入骨折部位后，對糖尿病骨折愈合的影響。
　　方法:
　　1.人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、鑒定及分化。
　　1.1 細胞培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)。獲取健康、足月、剖腹產(chǎn)胎兒臍帶，剝離臍帶wharton's jelly膠，充分剪碎，酶消化法獲得臍帶間充質(zhì)干細胞，體外傳代、純化、擴增，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
　　1.2 人臍帶間充質(zhì)干細胞的表面分子標(biāo)志檢測收集培養(yǎng)的第3代hUC-MSCs，加入CD1

7、4-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD34-FITC、、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC、MHCⅡ-FITC單克隆抗體，lgGl-PE、lgGl-FITC作為同型對照，24小時內(nèi)應(yīng)用流式細胞儀對細胞表面的CD分子進行鑒定。
　　1.3 人臍帶間充質(zhì)干細胞的成骨分化及成脂分化
　　1.3.1 收集第3代hUC-MSCs，以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)7天后，行堿性磷酸酶染色;誘導(dǎo)分化21天后，進

8、行茜素紅染色，檢測鈣化基質(zhì)沉淀。
　　1.3.2 收集第3代hUC-MSCs，以脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14天后，進行油紅O染色。
　　2.糖尿病動物骨折模型的制作。
　　2.1 糖尿病骨折動物模型的制作及分組。雄性Wister大鼠75只隨機分為三組:糖尿病組(n=25)、HUCMSCs組(n=25)、正常對照組(n=25)。糖尿病組及HUCMSCs組大鼠腹腔注射四氧嘧啶(160mg/kg)建立糖尿病動物模型，

9、當(dāng)血糖濃度血糖大于16.7mmol/l，則為糖尿病大鼠模型誘導(dǎo)成功。中途死亡和造模失敗的大鼠再行造模補充，以保證每次每組用于檢測的大鼠數(shù)量為5只。糖尿病模型制作成功后，在無菌條件下將三組動物均用手術(shù)方法于左脛骨上中1/3交界處用線據(jù)鋸斷脛骨人為造成左脛骨骨折。然后復(fù)位外固定。HUCMSCs組大鼠在骨折處用注射器穿刺至骨折端注射成骨誘導(dǎo)7天的第三代干細胞1×107個/Kg，正常對照組和糖尿病組注射等量的生理鹽水做為對照。
　　2.2

10、 骨密度檢測
　　對各組實驗動物在術(shù)后1周、2周、3周、4周、5周，每組隨機分別選取5只大鼠，然后使用DEXA骨密度儀掃描測定骨折處新生骨痂BMD，計算機記錄數(shù)據(jù)。檢測時骨密度儀設(shè)置為實驗小動物模式，以新生骨痂為中心由近至遠掃描1厘米范圍，每組標(biāo)本測量三次，每次測量前都重置標(biāo)本，取平均值。
　　2.3 組織學(xué)及免疫組化學(xué)檢查
　　手術(shù)后第1、2、3、4、5周，每組分別隨機抽取動物各5只大鼠，麻醉狀態(tài)下以骨折端為中心，切

11、取上下各0.5cm長標(biāo)本，一半取出后立即放入液氮中儲存（用于熒光定量RT-PCR檢測），一半立即置入10％福爾馬林中固定24小時，10％EDTA脫鈣、包埋完畢后，石蠟切片機將骨組織切成5μ m厚切片。常規(guī)進行病理切片的制作，免疫組化檢測按說明書進行。Leica-QwinV3圖像分析軟件檢測TGF-β1和BMP-2灰度值的變化。
　　2.4 熒光定量RT-PCR檢測
　　每組5只脛骨骨痂樣本在液氮中取出后，進行熒光定量RT-P

12、CR檢測。qRT-PCR采用SYBR綠色PCR試劑盒，不加模板和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物的做為陰性對照。用GAPDH作為RT-PCR的內(nèi)參，設(shè)定PCR程序。熒光定量PCR儀檢測相關(guān)數(shù)據(jù)并進行分析。
　　結(jié)果:
　　1.采用酶消化法能有效分離純化hUCMSCs。接種24時后，貼壁細胞形態(tài)多為長梭型、多邊形或成纖維細胞樣形態(tài)、大小均一，9天后成旋渦狀生長。流式細胞儀分析，第3代細胞高表達CD44、CD73、CD90及CD105，低表達D14

13、、CD34、CD45及MHCⅡ。經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后堿性磷酸酶染色呈強陽性，茜素紅染色可見明顯鈣結(jié)節(jié)，油紅O染色可見胞漿中紅色的油滴。
　　2.大鼠注射四氧嘧啶后，大部分在24～48 h后出現(xiàn)多飲、多食、多尿、血糖增高、呆滯、皮毛松散、體重下降等表現(xiàn)，血糖大于16.7mmol/l，糖尿病模型造模成功。
　　3.骨密度結(jié)果顯示:在術(shù)后第1周，三組大鼠骨痂局部骨密度測量值沒有明顯統(tǒng)計性差異(P＞0.05);但在術(shù)后第2，3，4，5周

14、，我們發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠組骨痂局部骨密度值隨著時間逐漸增加，但在相應(yīng)時間點其密度值明顯低于對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;hUC-MSCs組骨密度值在術(shù)后第2，3，4，5周高于糖尿病組，差異具備顯著性(P＜0.05)，但是與對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.組織學(xué)及免疫組化顯示:糖尿病鼠軟骨細胞及成骨細胞成熟延遲，骨痂形成較慢。免疫組化顯示:骨折后1-3周TGF-β1、BMP-2在細胞內(nèi)廣泛表達，特別是在骨痂和骨

15、膜內(nèi)，而糖尿病組骨痂組織中表達明顯低于正常組與hUC-MSCs治療組。hUCMSCs組和糖尿病組無明顯差別。
　　5.BMP-2、TGF-β1實時熒光定量RT-PCR檢查顯示:正常組斷端骨癡組織BMP-2在第2周達高峰，而糖尿病組在第3周達高峰;正常組斷端骨癡組織TGF-β1在第3周達高峰，而糖尿病組在第4周達高峰;糖尿病組TGF-β1、BMP-2表達比正常對照組均推遲1周，BMP-2、TGF-β1在hUC-MSCs組表達在第2、

16、3周均較糖尿病組高，但和正常對照組相比差別不大。
　　結(jié)論:
　　1.在體外應(yīng)用酶消化法能獲得人臍帶間充質(zhì)干細胞，人臍帶間充質(zhì)干細胞具有多向分化能力，可分化為成骨細胞及脂肪細胞。
　　2.糖尿病大鼠骨折后骨折愈合速度慢、愈合延遲。
　　3.糖尿病降低骨折處骨痂骨密度，影響骨折部位骨痂形成。
　　4.糖尿病明顯降低TGF-β1、BMP-2表達，進而影響大鼠骨折處骨痂形成，是引起骨折愈合差的原因之一。