體外誘導(dǎo)胚兔視網(wǎng)膜神經(jīng)干細(xì)胞與腦神經(jīng)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞分化的研究.pdf

1、本文分兩部分論述了體外誘導(dǎo)胚兔視網(wǎng)膜神經(jīng)干細(xì)胞與腦神經(jīng)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞分化的研究。 第一部分：胚兔視網(wǎng)膜及腦神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定。 目的：分離、培養(yǎng)和鑒定胚兔視網(wǎng)膜及腦NSCs細(xì)胞，并對(duì)不同培養(yǎng)條件進(jìn)行比較。 方法：取孕24天胚兔視網(wǎng)膜及大腦皮質(zhì)制備單細(xì)胞懸液，分別在5種不同培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)連續(xù)傳代使細(xì)胞純化。采用免疫熒光法及流式細(xì)胞儀檢

2、測(cè)不同培養(yǎng)條件下獲得的細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞抗原的表達(dá)。 結(jié)果：無(wú)血清培養(yǎng)基添加N2、EGF、bFGF、LIF四種因子組可以獲得最佳純化效果。傳三代后nestin(+)細(xì)胞較原代細(xì)胞明顯增高，說(shuō)明懸浮培養(yǎng)法可篩選出較高純度的NSCs。視網(wǎng)膜NSCs培養(yǎng)過(guò)程中nestin高于大腦皮質(zhì)NSCs。免疫熒光法顯示無(wú)血清培養(yǎng)條件下的兩種組織來(lái)源的NSCs都部分表達(dá)nestin。 第二部分：胚兔視網(wǎng)膜及腦神經(jīng)干細(xì)胞NS

3、Cs的體外誘導(dǎo)分化。 目的：體外誘導(dǎo)NSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞分化，并對(duì)不同誘導(dǎo)條件進(jìn)行比較。 方法：選取無(wú)血清條件下傳三代的NSCs，撤去生長(zhǎng)因子，分別在含5％FBS及5％FBS+全反式視黃酸(ATHA)的DMEM/F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo)8-10天，細(xì)胞生長(zhǎng)接近匯合時(shí)終止培養(yǎng)。通過(guò)免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)鑒定被誘導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞抗原的表達(dá)。 結(jié)果：誘導(dǎo)后NSCs生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞主要分化為類神

4、經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞。視網(wǎng)膜NSCs經(jīng)誘導(dǎo)后大部分突觸較短，可見(jiàn)類神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；大腦皮質(zhì)NSCs經(jīng)誘導(dǎo)后大部分突觸較長(zhǎng)，僅在經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后可偶然發(fā)現(xiàn)類神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)顯示兩種誘導(dǎo)方式都有部分細(xì)胞表達(dá) nestin，較誘導(dǎo)前均明顯降低，而Rodopsin及CD90(Thy-1)的表達(dá)均較誘導(dǎo)前明顯增高。經(jīng)5％FBS誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)Rodopsin較聯(lián)合應(yīng)用ATRA時(shí)高，但表達(dá)CD90低于后者。與未經(jīng)純化原代即以5％FBS培養(yǎng)的細(xì)胞相

5、比，經(jīng)純化再誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)Rodopsin及CD90較高。 結(jié)論：本試驗(yàn)采用懸浮篩選法成功分離和培養(yǎng)了高純度的視網(wǎng)膜及大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞。無(wú)血清培養(yǎng)基添加N2、EGF、bFGF、LIF四種因子可以獲得最佳純化效果。NSCs經(jīng)5％FBS或5％FBS+ATRA誘導(dǎo)后表達(dá)Rodopsin及CD90上調(diào)，經(jīng)5％FBS誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)Rodopsin較聯(lián)合應(yīng)用ATRA時(shí)高，但表達(dá)CD90低于后者。與未經(jīng)純化原代即以5％FBS培養(yǎng)的細(xì)胞相比，