99mTc-GSA對肝臟缺血再灌注損傷評估的實驗研究.pdf

1、引言：我國是肝炎尤其是乙肝高發(fā)國家，肝炎后肝硬化肝癌的發(fā)生率較高，肝癌的手術(shù)切除治療具有根治意義。在肝臟相關(guān)手術(shù)中，通常需要不同程度地阻斷肝血流，這就可能會發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）。HIRI的發(fā)病機制復(fù)雜，目前研究認為HIRI由多種因素共同作用導(dǎo)致大量的肝實質(zhì)細胞功能受損甚至死亡，是手術(shù)后肝功能衰竭的重要原因之一，故肝臟缺血再灌注后肝功能的準確預(yù)估對臨床醫(yī)

2、生評估患者預(yù)后，制定治療方案，提高患者術(shù)后恢復(fù)及生存率有一定臨床價值。
　　肝功能的評估方法很多，其中基于肝臟去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）顯像的肝功能評估方法可以動態(tài)觀察肝細胞的攝取、代謝、排泄等功能過程，并可以計算功能肝細胞量，被認為是目前正確評估肝功能很有前途的方法。目前較受關(guān)注的去唾液酸糖蛋白受體顯像劑是99mTc-GSA，其可與肝細胞膜表面的ASGPR特異性結(jié)合而

3、進行肝臟顯像，ASGPR的數(shù)量和功能與肝細胞的功能呈正相關(guān)，通過檢測肝細胞 ASGPR的數(shù)量和活性，可評估肝的功能狀況。肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷時，肝細胞發(fā)生不同程度的凋亡和壞死，肝細胞膜表面的ASGPR的數(shù)量和活性不同程度地下降，通過ASGPR顯像可了解肝功能狀況，評估HIRI造成的損傷，以便及時采取治療措施及評估預(yù)后。此外，99mTc-GSA肝臟SPECT/CT平面加斷層顯像還可評價區(qū)域肝功能，方法為在每個SPECT橫斷面上劃線模擬肝

4、切除，計算剩余或區(qū)域肝功能占整體肝功能的比例，該指標可評估肝臟儲備功能，預(yù)測手術(shù)風險，對臨床工作幫助很大，但計算操作較為復(fù)雜，為了適應(yīng)臨床需要,北京協(xié)和醫(yī)院建立了計算機程序,得到含有肝臟管道解剖結(jié)構(gòu)的三維立體功能影像，可用此程序模擬手術(shù)切除,計算出各部分肝臟的功能，使肝功能及區(qū)域肝功能的評估方法更具操作性，目前該程序正處于研究完善階段。
　　本研究通過構(gòu)建不同程度的兔肝臟缺血再灌注損傷模型，獲取肝臟不同損傷程度下的肝酶和病理結(jié)果，

5、而后進行99mTc-GSA兔肝顯像實驗，獲取顯像結(jié)果，分析顯像結(jié)果與肝酶和病理結(jié)果的相關(guān)性，探討99mTc-GSA對肝臟缺血再灌注損傷評估的可靠性，為臨床應(yīng)用99mTc-GSA預(yù)測肝臟缺血再灌注損傷以制定合理治療方案包括手術(shù)措施提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　第一部分、兔肝缺血再灌注損傷模型的建立
　　目的：采用新西蘭大白兔制作肝臟不同程度缺血再灌注損傷模型，探討肝不同缺血時間再灌注后的血清肝酶生化檢驗指標和組織病理的變化情況

6、，以及術(shù)后第3d、第7d上述指標的變化情況，為肝缺血再灌注后99mTc-GSA肝顯像評估肝功能提供病理學(xué)基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.實驗動物及分組
　　將體重沒有明顯差異、雌雄不拘的健康成年新西蘭大白兔隨機分為A、B、C、D四組，每組8只，設(shè)置三個缺血時間段：30min、45min、60min，其中A組設(shè)為假手術(shù)組，B組為缺血30min組，C組為缺血45min組，D組為缺血60min組，假手術(shù)組僅解剖肝十二指腸韌

7、帶，不阻斷血供。
　　2.兔肝缺血再灌注模型的制作及取材
　　采用無損傷血管夾夾閉兔肝蒂，按照分組分別阻斷30min、45min、60min，取出血管夾，恢復(fù)肝血流灌注1h后，取肝組織、采血。而后，在術(shù)后第3d和第7d對該四組兔子分別進行采血及超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺取肝組織。
　　3.標本處理
　　(1)血生化，取血后分離血清，測定ALT含量。
　　(2)組織經(jīng)福爾馬林固定后送往病理科進行HE染色觀察。

8、　　4.統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗所得數(shù)據(jù)及積分以均數(shù)±標準差(±s)形式表示，統(tǒng)計處理采用一般線性模型重復(fù)測量方差分析，先進行球形檢驗分析各組重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性，而后采用相應(yīng)的方差分析模型，檢驗標準以P<0.05認為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.血清酶學(xué)
　　假手術(shù)組，ALT基本在正常范圍內(nèi)。缺血再灌注組B、C、D組間比較，術(shù)后同一天，D組ALT水平最

9、高，即血流阻斷1h組，其次是阻斷45min組，最后是30min組。缺血再灌注組組內(nèi)ALT水平均是阻斷血流再灌注1h后最高，術(shù)后第3d下降，至術(shù)后第7d基本恢復(fù)至正常水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.肝組織HE病理
　　HE病理結(jié)果顯示，假手術(shù)組及術(shù)前肝組織病理形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，核深染；缺血再灌注組肝組織細胞不同程度地被損害，以夾閉60min組損害最重，其次是夾閉45min組，最后是夾閉30min組。缺血再灌注組組內(nèi)均是夾閉

10、血管再灌注1h后肝細胞損害最重，第3d損害程度有所減輕，至第7d進一步恢復(fù)，B組基本恢復(fù)至正常水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：兔肝缺血再灌注模型制作簡單、成功率高，制得的模型隨缺血時間的延長，肝酶升高，組織病理損害程度增加，缺血再灌注組再灌注1h損害最重，術(shù)后第3d、第7d逐漸恢復(fù)，這一梯度病理損害變化過程能很好地滿足下一步影像功能研究的需要。
　　第二部分、肝臟缺血再灌注損傷99mTc-GSA顯像的實驗研究
　　

11、目的：結(jié)合上述實驗動物的肝酶及病理指標變化情況，探討99mTc-GSA肝顯像評估HIRI后肝功能的價值。
　　材料與方法：
　　1.動物分組及HIRI模型的制作
　　實驗兔分為假手術(shù)組和缺血再灌注組，再灌注組根據(jù)缺血時間再分為三組（缺血30min、45min、60min），并在術(shù)后第3和第7d繼續(xù)隨訪實驗。
　　2.99mTc-GSA的制備及顯像參數(shù)
　　采用GSA試劑盒，按照文獻描述的方法制備99mTc-

12、GSA并檢測放化學(xué)純度，合格后用于顯像。對A、B、C、D四組術(shù)前、術(shù)后1h、術(shù)后3d及術(shù)后7d分別進行顯像。處理顯像結(jié)果，獲得肝臟攝取率(LHL15)與血液清除指數(shù)(HH15)。
　　3.血生化及病理檢驗
　　采血及病理檢查見第一部分。
　　4.結(jié)果處理
　　分析顯像結(jié)果，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理同第一部分，將顯像結(jié)果與血清肝酶及組織病理結(jié)果進行對比，采用Pearson相關(guān)檢驗分析相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1

13、.LHL15
　　缺血再灌注組肝臟攝取率最低的時間點均是T2，即阻斷血流再灌注1h后最低，其次是術(shù)后3d，術(shù)后7d有所恢復(fù)，假手術(shù)組攝取率基本處正常水平；組間比較，同一時間，D組攝取率最低，即血流阻斷1h組，其次是阻斷45min組，再次是30min組，假手術(shù)組基本處于正常水平。
　　2.HH15
　　組間比較，同一時間，D組HH15最大，即血流阻斷1h組，其次是阻斷45min組，再次是30min組，假手術(shù)組基本處于正常

14、水平；缺血再灌注組顯像劑血液清除指數(shù)值最大的時間點均是T2，即阻斷血流再灌注1h后值最大，其次是術(shù)后3d，術(shù)后7d減小，假手術(shù)組HH15基本處正常水平。
　　3.顯像結(jié)果與病理及肝酶的相關(guān)性分析
　　LHL15、HH15、ALT、HE組織病理評分這四個變量的Pearson相關(guān)檢驗結(jié)果示：LHL15與 HH15呈高度負相關(guān)，r=-0.967，p<0.01； LHL15與HE呈高度負相關(guān)，r=-0.957，p<0.01；LHL1