人重組IL-22蛋白的表達及其生物學特性的初步分析.pdf

1、白細胞介素22作為IL-10細胞因子家族的成員之一最初發(fā)現(xiàn)于2000年。其在體內(nèi)的主要來源是活化后的Th1細胞以及NK細胞。IL-22通過其異源二聚體的受體復合物表現(xiàn)其生物學活性。其受體屬于II型細胞因子受體超家族，分別為IL-22R1和IL-10R2。靜息狀態(tài)下或者活化后的免疫細胞中均不表達IL-22R1，而包括T細胞、B細胞、NK細胞等在內(nèi)的免疫細胞對IL-22的激發(fā)也不產(chǎn)生相應(yīng)的作用。而在皮膚、腎、消化道、呼吸系統(tǒng)等組織中的細胞是

2、IL-22的靶細胞。IL-22的生物學功能包括提高機體抵抗微生物入侵、保護組織抵御損傷以及修復非免疫系統(tǒng)組織等。除此以外IL-22還可以介導腫瘤細胞對血清淀粉樣蛋白、結(jié)合珠蛋白、α-1抗胰凝乳蛋白酶等急性反應(yīng)期蛋白表達上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明IL-22是一種新型的免疫分子，是由免疫細胞產(chǎn)生但起著調(diào)節(jié)組織抵御損傷和外源病原體感染的保護作用。 1.人白細胞介素22的克隆及原核表達 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的人IL-22基因序列設(shè)計合成

3、了去信號肽IL-22成熟鏈基因片段的特異性引物。采用RT-PCR的方法從人外周血PHA刺激活化的T細胞中克隆擴增了人IL-22去信號肽基因片斷。應(yīng)用BamHI單酶切酶切載體和目的基因片斷，膠回收酶切產(chǎn)物后以T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，經(jīng)酶切和煮菌PCR驗證陽性克隆。測序正確后，抽提質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化至宿主工程菌株M15。在LB細菌培養(yǎng)基中大量擴增M15工程表達菌，經(jīng)IPTG誘導表達產(chǎn)生hIL-22/His重組蛋白。經(jīng)過SD

4、S-PAGE電泳鑒定重組蛋白以包涵體的形式存在。包涵體經(jīng)過超聲波裂解和離心，沉淀變性和復性后經(jīng)親和層析柱純化。實驗結(jié)果表明，純化后的IL-22/His融合蛋白純度可達94％以上。應(yīng)用SDS-PAGE和WesternBlotting對融合蛋白進行鑒定，在相對分子量約為18kd的位置為人IL-22特異性條帶。 2.人重組IL-22蛋白生物學特性的初步分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人Gadd45b(Growth arrest an

5、d DNA-damage45 beta)、Gadd45g(growth arrest and DNA-damage45 gamma)、Serpin A3(serpin peptidaseinhibitor, clade A，member3)以及SAA2(serum amyloid A2)基因序列設(shè)計合成Real-Time PCR引物。對人肝癌細胞株HepG2、人結(jié)腸癌細胞株SW480分別加入終濃度為100ng/ml的人重組IL-22及商

6、品化人IL-22蛋白進行體外激發(fā)。于規(guī)定時間點收集細胞并使用Trizol抽提細胞Total RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。以相當于100ng TotalRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR檢測在上述細胞株上Gadd45b、Gadd45g、Serpin.A3、SAA2 mRNA的表達。結(jié)果顯示通過原核表達并純化的人重組IL-22與商品化人IL-22蛋白均能刺激上述細胞中相關(guān)基因的表達上調(diào)。由此表明，本實驗所研制的人重組IL-22具有良好的生物學活性