表達(dá)FMDV vp1基因的重組山羊痘病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、山羊痘是由山羊痘病毒 (Goat pox virus,GPV) 引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病.本病以發(fā)熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹和皰疹以及淋巴結(jié)病變?yōu)橹饕卣?被世界動物衛(wèi)生組織 (OIE) 列為A類重要傳染病.我國從40年代起出現(xiàn)了綿羊痘和山羊痘的感染與流行,近兒年我國各地特別是內(nèi)蒙、兩部地區(qū)常有羊痘感染的報道.該病發(fā)病率高,可導(dǎo)致妊娠母羊流產(chǎn),羔羊死亡率高,并有非典型癥狀及繼發(fā)、并發(fā)感染的情況.羊痘在我國的廣泛流行,給

2、我國養(yǎng)羊業(yè)以及毛皮加工行業(yè)的發(fā)展造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失.目前對于羊痘尚無特異的治療方法,主要依靠疫苗接種來預(yù)防.弱毒疫苗免疫效果比較好,而且免疫保護(hù)期長,但是現(xiàn)有診斷方法無法區(qū)分自然感染和弱毒疫苗免疫的動物,給疾病的鑒別診斷帶來了困難. 口蹄疫 (Foot and mouth,FMD) 是由口蹄疫病毒 (Foot and mouth virus,FMDV) 引起豬、牛、羊等偶蹄獸的一種急性熱性高度接觸性傳染病,嚴(yán)重危害家畜的生產(chǎn)力

3、和畜產(chǎn)品質(zhì)量,給畜牧業(yè)和進(jìn)出口貿(mào)易造成較大的經(jīng)濟(jì)損失,成為世界各國檢疫和防疫的重點(diǎn)對象,同樣被OIE列為A類重要傳染病.雖然山羊和綿羊不如牛和豬易感,但是山羊和綿羊感染FMDV后會長期帶毒,成為隱性帶毒者,這給該病的防制增加了難度.因此,山羊和綿羊在FMDV的流行和傳播過程中起著重要作用.VP1是FMDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,它暴露在病毒顆粒的表面,具有與細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn),是病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵,而且VP1能誘導(dǎo)產(chǎn)生FMDV中和抗體,因此VP

4、1成為研制基因工程疫苗的首選靶抗原. 本研究以我國廣泛使用的山羊痘弱毒疫苗株AV41為親本病毒,以胸苷激酶(thymidine kinase,TK) 基因為外源基因插入位點(diǎn),構(gòu)建重組山羊痘病毒.首先,克隆GPV基因組中包含TK基因的ORF64-ORF67片段作為同源臂,將其克隆至pMD18-T simple載體,得到重組質(zhì)粒pTK.經(jīng)測序和序列分析顯示,ORF64全長396bp,編碼病毒膜蛋白;ORF65全長444bp,ORF6

5、4和IORE65有44個堿基重疊.ORF66全長534bp,編碼胸苷激酶(TK),具有保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)和細(xì)胞中TK特征序列.ORF67全長594bp,編碼宿主范圍相關(guān)蛋白.與GPV參考毒株進(jìn)行比較,ORF64～ORF67序列僅存在較少差異,核苷酸和氨基酸同源性均較高(93.9～100﹪).其中TK與GPV參考毒株同源性96.8～100﹪,與國內(nèi)分離株同源性為100﹪.以上結(jié)果表明,GPV AV41與地方分離株有很高的同源性,是構(gòu)建重

6、組山羊痘病毒基因工程疫苗理想的親本毒株. 在以上研究的基礎(chǔ)上,首先構(gòu)建表達(dá)報告基因LacZ的重組山羊痘病毒rAY41-LacZ.先將痘苗病毒晚期啟動子P11控制下的LacZ基因表達(dá)盒插入到GPV轉(zhuǎn)移載體pTK的Kpn 1位點(diǎn),構(gòu)建了含報告基因LacZ的轉(zhuǎn)移載體pTK-LacZ.然后,通過脂質(zhì)體法將pTK-LacZ轉(zhuǎn)染已經(jīng)感染GPV AV41的犢牛睪丸細(xì)胞(bovine testes,BT) 細(xì)胞,經(jīng)過連續(xù)5輪藍(lán)斑篩選、純化以及P

7、CR鑒定,獲得了一株表達(dá)LacZ的重組rAV41-LacZ.將rAV41-LacZ在BT細(xì)胞和羔羊睪丸 (lamb testes,LT)細(xì)胞上連續(xù)傳25代,并進(jìn)行PCR檢測、病毒滴度測定.結(jié)果顯示,LacZ基因穩(wěn)定存在,rAV41-LacZ滴度與親本毒株相似,表明該重組病毒性狀穩(wěn)定,TK基因缺失對病毒增殖影響不大. 在成功構(gòu)建了表達(dá)LacZ的重組病毒rAV41-LacZ之后,以O(shè)型FMDV vpl基岡作為構(gòu)建重組病毒的靶抗原,以

8、rAV4l-LacZ為親本毒株,反向蝕斑篩選以除去LacZ基因,獲得了表達(dá)vp1基岡的重組病毒rAV41-VPl.本實驗將痘苗病毒早/晚期啟動子P7.5控制下的O型FMDV vpl基因表達(dá)盒插入到GPV轉(zhuǎn)移載體pTK的Kpn I位點(diǎn),構(gòu)建了含vpl基因的轉(zhuǎn)移載體pTK-VPl.以rAV41-LacZ為親本毒株,脂質(zhì)體法將pTK-VPl轉(zhuǎn)染BT細(xì)胞,經(jīng)過連續(xù)6輪反向蝕斑篩選、純化,經(jīng)PCR鑒定獲得了一株重組病毒rAV41-VPl.對vpl

9、基因PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測序驗證.經(jīng)Western blot、間接免疫熒光和生K動力學(xué)檢測,rAV41-VPl感染的細(xì)胞可以被Western blot方法檢測到VPl蛋白的表達(dá),用FMDV特異性抗體可以檢測到rAV41-VP1感染的細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光.與疫苗株比較,二者增殖特性無明顯差異,在BT和LT細(xì)胞上形成的蝕斑大小和形態(tài)相同.將rAV41-VPl在BT和LT細(xì)胞上連續(xù)傳12代,并對vpl基因進(jìn)行PCR檢測、病毒滴度測定、Westemblo