血漿miRNA在先天性心臟病繼發(fā)性肺動脈高壓的差異表達的篩選及其功能研究.pdf

1、肺動脈高壓(PAH)是左向右分流型先天性心臟病(CHD)常見的合并癥，相對于無PAH的先天性心臟病患者，合并PAH的CHD患者在手術(shù)后并發(fā)癥較多，極易引發(fā)死亡，醫(yī)護人員對患者的監(jiān)護難度加大，但不能有效降低死亡率。繼發(fā)性肺動脈高壓是先天性心臟病常見并發(fā)癥，目前，對此缺乏特異性無創(chuàng)診斷手段及藥物治療，嚴重影響了介入治療或外科手術(shù)的預(yù)后效果，也成為是患者手術(shù)后仍有很高死亡率的重要原因。
　　小RNA分子(miRNA)是一組約有21-23

2、個核苷酸的高度保守的非編碼RNA，廣泛存在于植物、微生物和哺乳動物中，在心血管疾病和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中，miRNA通過與靶基因的3'UTR區(qū)域部分序列相結(jié)合，互補后降解已轉(zhuǎn)錄的靶基因的mRNA，或者抑制靶基因編碼蛋白進而對各種疾病起到調(diào)節(jié)作用。
　　miRNA的表達具有高度特異性，使得在疾病中可能會有相同的一種或多種miRNA表達改變。因此，在研究某一疾病的表達譜時，需要納入大量患者樣本進行研究，進而發(fā)現(xiàn)共同的血漿miRN

3、A表達譜，同時需要經(jīng)過大規(guī)模的臨床試驗驗證，才能最終應(yīng)用于臨床實踐。
　　目的:
　　1.左向右分流先天性心臟病單純性室間隔缺損不繼發(fā)重度肺動脈高壓患者和繼發(fā)重度肺動脈高壓患者血漿中的miRNA差異表達譜的建立與驗證。2.關(guān)鍵差異miRNA與合并肺動脈高壓患者臨床資料相關(guān)性分析。3.關(guān)鍵miRNA在合并肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中的作用與機制研究。
　　方法:
　　1.差異表達譜構(gòu)建:隨機自2010年12月至2014年

4、8月入住廣東省心血管病研究所心兒科的患者中抽選6例診斷為室間隔缺損合并重度肺動脈高壓（VSD/PAH重度）的患者和6例不合并肺動脈高壓的患者。其中心臟手術(shù)中麻醉狀態(tài)下測壓導(dǎo)管直接測量肺動脈收縮壓、體循環(huán)收縮壓，選擇肺動脈收縮壓/體循環(huán)收縮壓Pp/Ps≥0.75的患者為VSD-PAH組;選擇肺動脈收縮壓/體循環(huán)收縮壓Pp/Ps＜0.30的患者為對照組VSD-NPAH組。收集入選病人的血樣標本6mL于EDTA抗凝管中，離心去雜質(zhì)后使用mRN

5、A抽提試劑盒提取血漿樣本的總mRNA，經(jīng)質(zhì)檢后采用丹麥Exiqon公司的miRNA微陣列芯片miRCURYTMArray進行雜交，用Axon GenePix4000B芯片掃描儀對圖像信號進行掃描，使用GenePixpro V6.0數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。
　　2.熒光定量PCR驗證:根據(jù)miRNA芯片檢測的結(jié)果結(jié)合文獻資料和生物信息學(xué)分析，從差異表達的miRNA分子中選取15個差異較為明顯的miRNA分子，擴大樣本到每組100例

6、，采用莖-環(huán)的RT-PCR方法研究方法進行檢測，并且cel-mir-39作為實驗中的內(nèi)參對PCR數(shù)據(jù)進行標準化處理，對差異表達譜進行初步驗證。各RNA數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，故使用非參數(shù)檢驗方法Mann-Whitney U test進行差異統(tǒng)計，以中位數(shù)±四分位數(shù)間距表達各組數(shù)據(jù)分布情況。
　　3.臨床資料相關(guān)性分析:巢式病例對照研究設(shè)計，入選單純先天性體-肺循環(huán)分流性心臟病患者及相關(guān)肺動脈高壓患者擴大樣本至每組100例，并詳細記錄

7、病人的年齡、體重、心臟各指標、血壓等各臨床指標等信息，采用Pearson相關(guān)分析經(jīng)驗證的差異miRNAs與各臨床檢測指標的相關(guān)性。
　　4.miRNA-16作用研究:轉(zhuǎn)染miR-16 mimics或inhibitor，細胞生長曲線實驗和細胞遷移實驗研究miR-16對細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　5.miRNA-16的靶基因預(yù)測和驗證:運用miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRBase、Pictar、Targetscan檢索miR

8、NA-16的靶基因;使用熒光定量-PCR和western Blot方法檢測miR-16對關(guān)鍵靶基因的調(diào)控作用;使用熒光素酶報告載體驗證miR-16對關(guān)鍵靶基因的直接調(diào)控作用。
　　6.miRNA-16作用機制研究:共同轉(zhuǎn)染miR-16 mimics或inhibitor以及關(guān)鍵靶基因過表達載體和關(guān)鍵靶基因siRNA，細胞生長曲線實驗和細胞遷移實驗研究miR-16發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機制。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯

9、片結(jié)果顯示與左向右分流先心病不合并肺動脈高壓者血漿相比，重度肺動脈高壓者血漿中101個miRNA表達上調(diào)超過3倍，54個miRNA表達下調(diào)超過3倍。
　　2.統(tǒng)計結(jié)果顯示，在所驗證的差異miRNA分子中，mirK12-8、mirK12-10a、mirK12-12、mirUS25-2、mir16、mir17a、mir19a、mir20a、mir21、mir22、mir92、mir98、mir143、mir204在合并肺動脈高壓中均表

10、達上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)，與芯片結(jié)果變化趨勢一致。
　　3.Stepwise法相關(guān)性分析顯示，目標miRNA在兩組患者中與其臨床指標具有明顯相關(guān)性。
　　4.miR-16的生物學(xué)功能:我們首先研究了miR-16對HPASMC細胞增殖的影響。使用Invitrogen公司的siRNA轉(zhuǎn)染試劑在PAH細胞和細胞中分別轉(zhuǎn)染由吉瑪公司合成的miR-16 mimics和inhibitor，細胞增殖實驗顯示，在HPASMC細

11、胞中過表達miR-16可以促進HPASMC細胞的增殖;我們采用劃痕實驗檢測HPASMC細胞轉(zhuǎn)染miR-16之后的遷移能力。實驗結(jié)果表明，與miR-16 mimicsNC轉(zhuǎn)染對照組相比，miR-16 mimics能使HPASMC細胞的遷移能力明顯增強。與之相反的，同miR-16 inhibitor NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-16 inhibitor能使HPASMC細胞的遷移能力減弱。以上實驗結(jié)果表明，miR-16能夠顯著促進HPASMC細胞

12、的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　5.miR-16的靶基因預(yù)測及驗證:使用三個較為權(quán)威的數(shù)據(jù)庫Target Scan在線軟件、Pic Tar在線軟件和MiRanda在線軟件對的miRNA-16的靶基因進行預(yù)測，其中有33個靶基因在三個數(shù)據(jù)庫共同被預(yù)測到。RT-qPCR的實驗結(jié)果顯示，在HPASMC中過表達miR-16后，RBM6的mRNA水平下降明顯，而轉(zhuǎn)染inhibitor組結(jié)合剛好相反。Western Blot的實驗結(jié)果顯示，miR

13、-16能夠下調(diào)細胞中RBM6的蛋白水平，抑制miR-16的表達可以上調(diào)RBM6的蛋白水平。熒光素酶報告系統(tǒng)實驗顯示，轉(zhuǎn)染miR-16 mimics有效抑制了連有RBM63'UTR區(qū)PGL4載體上的熒光素酶活性，RBM63'UTR突變區(qū)則無效果;相反的，而共同轉(zhuǎn)染miR-16 inhibitor的239T細胞中熒光素酶活性明顯增強，而RBM63'UTR突變區(qū)則無效果。
　　6.miR-16通過靶向在HPASMC中的作用:本課題利用細

14、胞遷移實驗明確RBM6在miR-16促進細胞轉(zhuǎn)移中的作用。在HPASMC細胞中加入miR-16的mimics后，過表達RBM6，然后檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。實驗結(jié)果顯示，加入miR-16的mimics后，細胞劃痕間距明顯縮短，增強了HPASMC細胞的遷移能力。在細胞中回補RBM6后，可以將miR-16促進的細胞遷移能力抑制回原來的75％作用。以上結(jié)果顯示，下調(diào)內(nèi)源性RBM6蛋白表達可以抑制細胞遷移和侵襲能力。同時，可以部分恢復(fù)mi

15、R-16對細胞遷移和侵襲的促進作用。綜上所述，miR-16可能通過下調(diào)細胞RBM6的表達而促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1.芯片結(jié)果證實先天性心臟病合并重度肺動脈高壓和為合并患者血漿中存在差異表達的miRNAs，提示血漿miRNAs在繼發(fā)性重度肺動脈高壓中起一定的調(diào)控作用。
　　2.利用莖環(huán)熒光定量PCR對芯片中部分差異表達的miRNAs的表達進行大樣本驗證，證實芯片結(jié)果可靠。
　　3.經(jīng)生物信息學(xué)