消癌平聯(lián)合細胞周期特異性化療藥對lewis肺癌小鼠移植瘤生長的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是一種常見的惡性腫瘤，雖然目前以手術、放療、化療為主的綜合療法治療肺癌取得了一定發(fā)展，但由于化療藥物耐藥現(xiàn)象及其嚴重的毒副反應等，肺癌治療的仍未能取得令人滿意的效果，因此研究中藥抑瘤作用機制具有重要的理論意義和應用價值，消癌平為中藥通關藤的提取物，目前已廣泛應用于臨床，常用于肺癌和消化道腫瘤等。迄今國內(nèi)學者對其作用機制進行了一系列的研究。但消癌平與細胞周期特異性藥物聯(lián)合應用研究甚少，本實驗旨在研究消癌平對lewis

2、肺癌小鼠移植瘤生長的影響及其與細胞周期特異性化療藥聯(lián)合應用抗腫瘤效果，為消癌平應用于肺癌的臨床治療提供一些新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　預實驗:
　　(1)取對數(shù)增長期的lewis單細胞懸液（細胞濃度106個/ml）0.2ml皮下種植于C57BC/L小鼠腋下，數(shù)量共10只，后觀察小鼠的生存的狀態(tài)及小鼠成瘤時間。
　　(2)用上述方法再次復制Lewis肺癌小鼠模型，數(shù)量共30只，將上述小鼠隨機分成2組，每組15只

3、，于種植后第10天分別腹腔注射生理鹽水0.2ml/只，消癌平注射液(0.2ml/只，40mg/ml)，分別于第12天、14天和第16天處死小鼠5只。將部分瘤組織剪碎，加入少量0.01mmoL/l磷酸鹽緩沖液，用300目尼龍網(wǎng)過濾，將濾液離心，棄上清，PBS沖洗3次，每管加入1ml75％乙醇，邊加邊震蕩，將單細胞固定后，于-20℃凍存，上機測定前復蘇，離心去除乙醇，PBS沖洗2次，每管加入用生理鹽水配制的含0.5％TritonⅩ-100、

4、1％RNA酶，5％PI的混合溶液0.5ml，30min后用300日尼龍網(wǎng)過濾，取濾液，用流式細胞儀分析細胞周期。
　　實驗:
　　(1)實驗動物分組及給藥:復制Lewis肺癌小鼠模型，數(shù)量共60只，將60只造模后的小鼠隨機分成6組，每組10只，于種植后第10天開始給藥，根據(jù)人鼠給藥劑量換算公式計算給藥劑量，其給藥劑量及時間如下:
　　1組:生理鹽水0.2ml/只（d10-d28腹腔注射）
　　2組:消癌平0.2m

5、l/只，（消癌平注射液40mg/ml,d10-d28腹腔注射）
　　3組:氟尿嘧啶0.2ml/只（氟尿嘧啶3mg/ml d14、d18、d22、d25腹腔注射，其他時間用生理鹽水，腹腔注射，至第28天）
　　4組:消癌平0.2ml/只（消癌平注射液40mg/ml，d10-d14腹腔注射），第14天開始用氟尿嘧啶，氟尿嘧啶0.2ml/只（氟尿嘧啶3mg/ml d14、d18、d22、d25腹腔注射，其他時間用消癌平，至第28天

6、）
　　5組:絲裂霉素0.2ml/只（絲裂霉素0.04mg/ml d14、d18、d22、d25腹腔注射，其他時間用生理鹽水，腹腔注射，至第28天）
　　6組:消癌平0.2ml/只（消癌平注射液40mg/ml，d10-d14腹腔注射），第14天開始用絲裂霉素，絲裂霉素0.2ml/只（絲裂霉素0.04mg/ml d14、d18、d22、d25，腹腔注射，其余時間用消癌平，至第28天）
　　(2)觀察各組生長情況:每3-4

7、天用游標卡尺測腫瘤長徑(a)和垂直徑(b)，腫瘤體積=ab2/2，繪制瘤體體積生長曲線，于第28天脫頸處死所有小鼠，并計算小鼠的腫瘤生長抑制率。
　　(3) VEGF免疫組化:腫瘤組織用福爾馬林固定12h后，石蠟包埋待用，嚴格按說明書操作，測定血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)表達情況。蛋白表達的定量結果在高倍鏡下(X400)計算陽性細胞陽性面積的百分比(％)，每張切片隨機選取5個視野，求平均值。VEGF蛋白表達陽性判斷標準A:染色

8、強度:陰性0分，淺棕色1分，棕黃色2分，深棕黃色3分;B陽性細胞比例:1/3以下為1分，I/3～2/3為2分，2/3以上為3分，積分數(shù)=A×B，A×B=0為陰性，A X B=1～4分為弱陽性，A X B＞4分為強陽性，高表達。
　　(5)統(tǒng)計結果分析:所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0 for Windows軟件進行分析，以探討消癌平的抑瘤機制及消癌平聯(lián)合細胞周期特異性化療藥的抑瘤效果。
　　結果:
　　1、成瘤時間:復制

9、Lewis肺癌細胞模型，小鼠于接種腫瘤后9天可觸及粟粒大小結節(jié)。
　　2、細胞周期:第12天消癌平組G1期:0.3220±0.02950，生理鹽水組G1期:0.3340±0.0336，兩兩比較P＞0.05，未見統(tǒng)計學差異，第14天消癌平組G1期:0.5540±0.04827，生理鹽水組G1期:0.2900±0.03536，兩兩比較P＜0.05，第16天消癌平組G1期:0.5920±0.03701，生理鹽水組G1期:0.2980±0

10、.04324，兩兩比較P＜0.05，第12天消癌平組G1期:0.3220±0.02950和第14天消癌平組G1期:0.5540±0.04827，兩兩比較P＜0.05，第14天消癌平組G1期:0.5540±0.04827與第16天消癌平組G1期:0.5920±0.03701，兩兩比較P＞0.05，雖然第16天G1期較第14天G1期高，但兩者比較無差異。
　　3、腫瘤體積:于種植后第9天后可觸及粟粒大小的腫瘤結節(jié)，各組于第18天之前腫

11、瘤體積未見明顯變化，第18天后可見生理鹽水組腫瘤體積大于各實驗組，于第28天生理鹽水組腫瘤體積大于各實驗組，消癌平組大于其余各實驗組，絲裂霉素組和消癌平聯(lián)合絲裂霉素組未見統(tǒng)計學差異，氟尿嘧啶組和消癌平聯(lián)合氟尿嘧啶組未見統(tǒng)計學差異。
　　4、腫瘤生長抑制率及瘤重:生理鹽水組、消癌平組、氟尿嘧啶組，消癌平聯(lián)合氟尿嘧啶組，絲裂霉素組、消癌平聯(lián)合絲裂霉素組各組分別存活5只、7只、5只、5只、5只、7只，消癌平組、氟尿嘧啶組，消癌平聯(lián)合氟尿

12、嘧啶組，絲裂霉素組、消癌平聯(lián)合絲裂霉素組各組抑制率分別為22.6％，60.8％，72.7％，37.4％，42.9％，生理鹽水組瘤重9.72±0.47g，消癌平組瘤重7.52±0.39g，氟尿嘧啶組瘤重3.80±0.95g，消癌平聯(lián)合氟尿嘧啶組瘤重2.65±0.79g，絲裂霉素組瘤重6.08±0.42g，消癌平聯(lián)合絲裂霉素組5.54±0.41g，統(tǒng)計結果示:生理鹽水組與各實驗組可見統(tǒng)計學差異，消癌平組、絲裂霉素組、消癌平聯(lián)合絲裂霉素組3組

13、比較未見統(tǒng)計學差異，氟尿嘧啶組，消癌平聯(lián)合氟尿嘧啶組2組比較未見統(tǒng)計學差異。
　　5、VEGF免疫組化:生理鹽水組，消癌平組，氟尿嘧啶組，消癌平聯(lián)合氟尿嘧啶組，絲裂霉素組，消癌平聯(lián)合絲裂霉素組各組強陽性率分別為:80.0％，57.1％，40％，20％，40％，42.8％，各組經(jīng)卡方檢驗未見統(tǒng)計學差異。
　　結論:
　　1、消癌平對Lewis小鼠移植瘤有顯著抑制作用。
　　2、消癌平對G1期瘤體細胞有明顯的阻斷作用

14、，使瘤體細胞主要停留在G1期，G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例明顯減少。
　　3、消癌平聯(lián)合G1期細胞周期特異性化療藥絲裂霉素能改善小鼠生存狀態(tài)，降低小鼠死亡率。
　　4、消癌平聯(lián)合G1期細胞周期特異性化療藥絲裂霉素抑瘤率高于單用絲裂霉素，據(jù)此推斷消癌平聯(lián)合G1期細胞周期特異性化療藥抑瘤效果強于單用G1期細胞周期特異性化療藥。
　　5、生理鹽水組VEGF表達高于各試驗組，氟尿嘧啶組，消癌平聯(lián)合氟尿嘧啶兩組VEGF