NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生過程中循環(huán)microRNA標(biāo)志物研究.pdf

1、研究背景:
　　 眾所周知，煙草類制品特別是香煙煙霧中含有大量的致肺癌化學(xué)物質(zhì)，包括4-(甲基亞硝胺基)-1-（3-吡啶）-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK]，多環(huán)芳烴類（如苯并芘），重金屬及各類復(fù)雜有機(jī)物等。在這些致癌物中，NNK是一種煙草特異性的N-亞硝胺類物質(zhì)，雖然煙草中含有大量的致肺癌物質(zhì)，但NNK在吸煙導(dǎo)致肺癌發(fā)生過程中起著關(guān)鍵的作用。大量研

2、究表明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系統(tǒng)給予低劑量NNK，主要誘導(dǎo)肺腺瘤和腺癌發(fā)生。
　　 肺癌是目前世界上死亡率最高的腫瘤之一。大量流行病學(xué)研究表明大多數(shù)肺癌的發(fā)生與吸煙有著密切的關(guān)系。盡管我們在提高戒煙和改善肺癌病人的治療方面做了大量的工作，但目前肺癌的5年生存率仍然較低（約15％），近30年來并沒有明顯改善。究其原因，缺乏有效的早期診斷肺癌的生物標(biāo)志物是其中一個(gè)重要的原因。相關(guān)報(bào)道指出，有效的早期肺癌診斷標(biāo)志物可能顯著提高肺癌的5年生存率至5

3、0％左右。因此，探尋肺癌早期生物標(biāo)志物對當(dāng)前改善肺癌的治療具有重要的意義。
　　 MicroRNA(miRNA)是一類約19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性的非編碼RNA。通常在轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控mRNA的表達(dá)，參與多種生物學(xué)過程，包括腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞生長與增殖、凋亡及發(fā)育等。眾多研究數(shù)據(jù)表明，在肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌及結(jié)直腸癌等多種癌癥組織樣本中均可檢測到miRNA的表達(dá)異常，而且miRNA差異表達(dá)譜能有效分類不同類型的腫瘤

4、。近年幾個(gè)研究表明，循環(huán)miRNA對于多種癌癥的檢測是一種潛在的穩(wěn)定的無創(chuàng)性的標(biāo)志物。這些研究都一致性的表明循環(huán)miRNA是癌癥的一種潛在的穩(wěn)定的生物標(biāo)志物。
　　 近來的幾個(gè)研究表明，化學(xué)致癌物可誘導(dǎo)miRNA表達(dá)改變。雄性F344大鼠飲水中持續(xù)喂飼NNK20周可導(dǎo)致大鼠肺組織miRNA表達(dá)改變。據(jù)我們所知，迄今為止化學(xué)致癌物誘導(dǎo)循環(huán)miRNA表達(dá)改變的相關(guān)研究還少見報(bào)道。化學(xué)致癌物誘導(dǎo)癌癥發(fā)生一般分為四個(gè)階段:起始階段、促進(jìn)

5、階段、進(jìn)展階段和惡性轉(zhuǎn)化階段。而在NNK誘導(dǎo)大鼠肺癌發(fā)生發(fā)展各階段，相關(guān)循環(huán)miRNA是否發(fā)生表達(dá)改變還不清楚。因此，我們假設(shè)某些循環(huán)miRNA在NNK誘導(dǎo)大鼠肺癌發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)生了改變而且和NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生密切相關(guān)。以往的研究表明，雄性F344大鼠對于NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生是一種較敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而且劑量反應(yīng)關(guān)系顯示低劑量的NNK持續(xù)處理主要誘導(dǎo)肺腫瘤發(fā)生，很少出現(xiàn)其他器官腫瘤發(fā)生。在本研究中，雄性F344大鼠持續(xù)給予NNK以誘導(dǎo)大

6、鼠肺癌發(fā)生。利用這一動(dòng)物模型，分別收集NNK處理第1、5、10、20、40、60、80和95周大鼠血液并分離血清運(yùn)用小分子RNA Solexa測序方法檢測血清miRNA差異表達(dá)譜，接著運(yùn)用定量RT-PCR方法，檢測大鼠個(gè)體血清中候選差異表達(dá)miRNA的表達(dá)情況，篩選出有意義的差異表達(dá)miRNA(miR-206和miR-133b)。進(jìn)一步分析miR-206和miR-133b在NNK誘導(dǎo)大鼠肺癌發(fā)生發(fā)展各階段大鼠血清中的表達(dá)情況。為進(jìn)一步鑒

7、定miR-206和miR-133b作為肺癌標(biāo)志物的潛力，我們分別檢測了miR-206和miR-133b在大鼠肺癌組織、肺癌細(xì)胞系及肺癌人群血清樣本的表達(dá)情況。以求探尋NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生發(fā)展過程中潛在的有效的血清miRNA標(biāo)志物，為肺癌的早期檢測生物標(biāo)志物研究積累重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。并通過計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-206和miR-133b的靶基因及其功能，為進(jìn)一步研究循環(huán)miRNA在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)癌癥發(fā)生過程的功能作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

8、r>　　 研究目的:
　　 (1)雄性F344大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，皮下注射低劑量NNK（每周3次，持續(xù)20周），然后常規(guī)喂養(yǎng)大鼠至95周以誘導(dǎo)大鼠肺癌發(fā)生，建立NNK誘導(dǎo)大鼠肺癌發(fā)生模型;
　　 (2)運(yùn)用小分子RNA Solexa測序方法檢測NNK處理組和對照組血清miRNA差異表達(dá)譜，篩選出候選差異表達(dá)miRNA;
　　 (3)運(yùn)用定量RT-PCR方法，檢測大鼠個(gè)體血清中候選差異表達(dá)miRNA的表達(dá)情況，篩選出

9、有意義的差異表達(dá)miRNA(miR-206和miR-133b);
　　 (4)鑒定NNK誘導(dǎo)大鼠肺癌發(fā)生不同階段血清中miR-206和miR-133b表達(dá)水平;
　　 (5)從大鼠血清，大鼠肺癌組織，肺癌細(xì)胞系及肺癌患者血清等多個(gè)水平鑒定miR-206和miR-133b作為肺癌生物標(biāo)志物的潛力，為探尋致癌物誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的miRNA標(biāo)志物研究積累重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 研究方法:
　　 (1)NNK誘導(dǎo)大鼠

10、肺癌模型的建立對照組大鼠皮下注射0.3 ml生理鹽水，NNK處理組大鼠皮下注射NNK溶液(1.15mg/kg，0.0055mmol/kg)，NNK溶液每次注射前根據(jù)大鼠體重臨用前新鮮配制，溶解在0.3 ml生理鹽水中，每周注射3次，連續(xù)20周，之后動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)于SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，至第95周剖殺。
　　 (2)大鼠血清小RNA Solexa測序在NNK處理第60周，分別從對照組大鼠和NNK處理組大鼠取等量血清混合，分別制備對照組混

11、合血清和NNK處理組混合血清，送深圳華大基因公司進(jìn)行小分子RNA Solexa測序，分析對照組和NNK處理組血清miRNA差異表達(dá)譜。
　　 (3)大鼠個(gè)體血清候選miRNA表達(dá)分析根據(jù)miRNA差異表達(dá)譜篩選出候選miRNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，在第60周大鼠個(gè)體血清中鑒定這些候選miRNA的表達(dá)水平。確定顯著差異表達(dá)的miRNA(miR-206和miR-133b)。
　　 (4)NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生不同階段大

12、鼠血清中miR-206和miR-133b表達(dá)分析運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，以miR-16為內(nèi)參，分析第1、5、10、20、40、60、80和95周大鼠血清中miR-206和miR-133b表達(dá)變化。
　　 (5)大鼠肺組織中miR-206和miR-133b表達(dá)分析運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，以RNUB6為內(nèi)參，檢測大鼠肺組織及肺癌組織中miR-206和miR-133b表達(dá)水平。
　　 (6)肺癌細(xì)胞系中miR-20

13、6和miR-133b表達(dá)分析運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，以RNUB6為內(nèi)參，檢測肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、QG56、H446、H1299、95-D及16HBE-T細(xì)胞中miR-206和miR-133b表達(dá)水平。
　　 (7)鑒定健康人和肺癌患者血清中miR-206和miR-133b表達(dá)水平。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，以miR-16為內(nèi)參，檢測健康人和肺癌患者血清中miR-206和miR-133b表達(dá)水平。
　　 (8)生

14、物信息學(xué)分析:為了預(yù)測miR-206和miR-133b在肺癌發(fā)生發(fā)展過程可能產(chǎn)生的功能作用，我們選擇miRNA靶基因預(yù)測軟件(http://www.microma.org/microma/)對miR-206和miR-133b進(jìn)行靶基因預(yù)測，并篩選出miR-206和miR-133b共同的靶基因，分析是否有些共同靶基因參與了肺癌或腫瘤的發(fā)生。另外通過網(wǎng)絡(luò)計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)資源http://acgt.cs.tau.ac.il/fame/inde

15、x.html預(yù)測miR-206和miR-133b的功能。同時(shí)通過http://www.genome.jp/kegg/pathway/對miR-206和miR-133b參與調(diào)控的信號通路進(jìn)行分析，以發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-133b參與到的和癌癥通路或非小細(xì)胞肺癌通路相關(guān)一些靶基因。
　　 (9)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)進(jìn)行各組數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)。對于參數(shù)比較

16、，兩獨(dú)立樣本比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);配對樣本采用配對樣本t檢驗(yàn);多組樣本比較采用單因素方差分析。對于非參數(shù)比較，兩樣本比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn);多組樣本比較采用Kruskall-Wallis檢驗(yàn)。腫瘤發(fā)生率的比較采用Fisher's確切概率檢驗(yàn);兩變量的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。為評價(jià)血清miRNA作為標(biāo)志物的預(yù)測值，采用受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic，

17、ROC)分析評價(jià)其區(qū)分正常人與肺癌病人的能力。計(jì)量資料均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，設(shè)定P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1) NNK誘導(dǎo)肺癌動(dòng)物模型的建立在NNK處理后第95周，對照組7只大鼠僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)肺部腫瘤，NNK處理10只大鼠發(fā)現(xiàn)19個(gè)肺部腫瘤，對照組大鼠組織病理切片結(jié)果顯示為正常肺支氣管上皮細(xì)胞形態(tài);NNK處理組肺腫瘤顯示為中低分化的肺腺癌。比較對照組與NNK處理組腫瘤

18、發(fā)生率分別為1/7和9/10，兩組腫瘤發(fā)生率之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004);兩組間腫瘤大小比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(t=6.286，P＜0.001)。
　　 (2)血清miRNA差異表達(dá)譜387個(gè)已知的大鼠miRNA中181個(gè)miRNA在對照組和NNK處理組血清中能檢測到。在對照組與NNK處理組血清之間82個(gè)miRNA表達(dá)具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對照組血清相比，NNK處理組血清中，37個(gè)miRNA表達(dá)顯著性上調(diào);45個(gè)

19、miRNA表達(dá)顯著性的下調(diào);99個(gè)miRNA表達(dá)在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在能檢測到的181個(gè)miRNA中進(jìn)行兩組血清之間公共及特有表達(dá)的miRNA分析顯示，20個(gè)miRNA特有性表達(dá)的在對照組血清中;8個(gè)miRNA特有性表達(dá)在NNK處理組血清中;其余153個(gè)miRNA在兩組血清均有表達(dá)。
　　 (3)大鼠個(gè)體血清中候選miRNA表達(dá)分析對照組血清相比，NNK處理組血清中miR206(U=21.00,P=0.012),miR-13

20、3b(U=26.00,P=0.030)和miR-382(U=24.00，P=0.021)表達(dá)水平均顯著性上調(diào)（Mann-Whitney檢驗(yàn)）。MiR-365，miR-34c，miR-20a，miR-29b，miR-30e，miR-183，miR-331和miR-195在兩組大鼠個(gè)體血清中表達(dá)水平未見顯著性差異(P＞0.05)。同時(shí)，我們對3個(gè)有顯著性差異的miRNA(miR-206，miR-133b和miR-382)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在大

21、鼠個(gè)體血清中miR-206和miR-133b的表達(dá)水平具有明顯的相關(guān)性，Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)顯示二者的表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.758，95％可信區(qū)間為0.339-0.926，P=0.003。
　　 (4)NNK誘導(dǎo)大鼠肺癌發(fā)生不同階段血清miR-206和miR-133b表達(dá)分析相對于對照組血清，NNK處理組血清中miR-206和miR-133b表達(dá)水平在第1、5、10、20、40、60和80

22、周均上調(diào)，miR-206上調(diào)倍數(shù)分別為1.43±0.11(t=-6.744，P=0.003);1.59±0.32(t=-3.215,P=0.032);2.17±0.35(t=-5.735,P=0.029);4.82±0.88(t=-7.497, P=0.017);3.23±0.99(t=-3.876, P=0.018);2.41±0.15(t=-16.250,P=0.004);1.85±0.12(t=-12.035，P=0.007);m

23、iR-133b上調(diào)倍數(shù)分別為1.08±0.10(t=-1.485, P=0.276);1.45±0.08(t=-9.208, P=0.011);2.12±0.25(t=-7.774,P=0.016);2.68±0.03(t=-97.887, P＜0.001);2.33±0.17(t=-13.238, P＜0.001);1.82±0.16(t=-8.953，P=0.001);1.30±0.16(t=-3.156，P=0.034)。可見在2

24、0周前大鼠血清中miR-206和miR-133b相對表達(dá)水平呈上升趨勢，在20周達(dá)高峰，之后其表達(dá)水平又逐漸下降。到第95周，相對于對照組血清，NNK處理組血清中miR-206和miR-133b表達(dá)水平下調(diào)，其下調(diào)倍數(shù)分別為2.09±0.64(t=5.769，P=0.004),2.78±0.30(t=26.813, P=0.001)。
　　 (5)大鼠肺組織及肺腫瘤中miR-206和miR-133b表達(dá)分析在9對NNK處理組肺腫

25、瘤及其對應(yīng)的正常肺組織中，相對于正常肺組織，在配對的肺腫瘤組織中miR-206和miR-133b均出現(xiàn)低水平表達(dá)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對t檢驗(yàn)）。同時(shí)我們檢測了7只對照組大鼠肺組織中miR-206和miR-133b的表達(dá)水平，采用單因素方差分析檢驗(yàn)各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，三組間miR-206(F=16.376，P＜0.001)和miR-133b(F=11.001，P＜0.001)表達(dá)水平具有顯著性差異。如圖3-16C和D所示，與對照組

26、正常肺組織相比，NNK處理組中正常肺組織miR-206(P=0.001)和miR-133b(P=0.019)顯著性低表達(dá);在NNK處理組肺腫瘤組織中miR-206(p＜0.001)和miR-133b(p＜0.001)顯著低表達(dá)。相對于NNK處理組正常肺組織，NNK處理組肺腫瘤組織中miR-206(P=0.048)和miR-133b(P=0.031)也顯著低表達(dá)。
　　 (6)肺癌細(xì)胞系中miR-206和miR-133b表達(dá)分析相

27、對16HBE細(xì)胞，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，QG56，H446，H1299，95-D和16HBE-T細(xì)胞中miR-206表達(dá)水平分別下調(diào)28.341±3.435，97.638±16.922，33.999±11.882，33.055±16.138，23.424±3.899和31.688±12.306倍;相對于16HBE細(xì)胞，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，QG56，H446，H1299，95-D和16HBE-T細(xì)胞中miR-133b（圖3-12B）表達(dá)水平

28、分別下調(diào)1.793±0.410，3.926±2.014，2.894±2.135，3.768±0.734，2.176±0.710和2.652±1.186倍。
　　 (7)肺癌和健康人血清中miR-206和miR-133b表達(dá)分析與健康人血清相比，肺癌患者血清中miR-206（圖3-13A）和miR-133b（圖3-13B）顯著性低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(miR206-U=61.00，miR133b-U=80.00，P＜0.001

29、，Mann-Whitney檢驗(yàn))。miR-206和miR-133b的ROC曲線分析結(jié)果顯示miR-206和miR-133b ROC曲線下面積（Areas under curve，AUC）分別為0.9024(95％CI=0.8125-0.9923)和0.8720(95％CI=0.7734-0.9706)。
　　 (8)通過靶基因預(yù)測，人類miR-206和miR133b分別預(yù)測有7201和5314個(gè)靶基因，其中2577個(gè)基因是他們共

30、同的靶基因。通過功能預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)miR-206參與了6個(gè)KEGG信號通路，包括VEGF信號通路、P53信號通路、煙酸和煙酰胺的代謝、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的SNARE相互作用、谷胱甘肽代謝和嗅覺傳導(dǎo)；miR-133b參與了2個(gè)KEGG信號通路，包括Notch信號通路和脂質(zhì)代謝。其中，P53信號通路和Notch信號通路與癌癥發(fā)生密切相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)NNK處理第60周大鼠血清進(jìn)行小分子RNA Solexa測序分析，結(jié)果

31、表明NNK處理可誘導(dǎo)血清miRNA表達(dá)發(fā)生改變。
　　 (2)通過大鼠個(gè)體血清中差異表達(dá)miRNA的實(shí)時(shí)定量分析，發(fā)現(xiàn)NNK處理組大鼠血清miR-206和miR-133b較對照組血清顯著性高表達(dá)，而且血清miR-206和miR-133b的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān);在大鼠肺癌組織，肺癌細(xì)胞系以及肺癌患者血清中，miR-206和miR-133b也呈現(xiàn)協(xié)同變化的關(guān)系，可能作為腫瘤抑制miRNA參與NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生發(fā)展。