沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pORF5引起的宿主差異蛋白的篩選及功能初步研究.pdf

1、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）pORF5（pgp3）是由質(zhì)?；蚓幋a的唯一一種分泌到宿主細(xì)胞胞漿中的分泌性質(zhì)粒蛋白，與毒力密切相關(guān)，但pORF5在Ct致病過程中的分子機制和功能還不甚明了。本研究試圖探討在Ct致病過程中與質(zhì)粒蛋白pORF5相互作用的宿主蛋白及其功能，為深入研究Ct的致病機制提供實驗依據(jù)。構(gòu)建pORF5基因慢病毒表達(dá)載體，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒，收集慢病毒后感染He

2、La細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)多次分選篩選陽性細(xì)胞克隆，獲得pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞系（pORF5-HeLa細(xì)胞系）和對照HeLa細(xì)胞系，實時定量PCR（qRT-PCR）和Western blotting分別鑒定pORF5的mRNA和蛋白表達(dá)水平。采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（2DLC-MS/MS）技術(shù)建立pORF5-HeLa細(xì)胞系和對照HeLa細(xì)胞系的全細(xì)胞蛋白表達(dá)譜，構(gòu)建差異蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)

3、庫；qRT-PCR驗證部分差異蛋白mRNA的表達(dá)水平。應(yīng)用DAVID在線生物信息學(xué)分析軟件、在線STRING軟件分析和在線KEGG PATHWAY Database軟件分析等生物信息學(xué)方法對差異蛋白進行GO（基因本體）分子功能注釋、蛋白質(zhì)相互作用及 KEGG信號通路分析，預(yù)測差異表達(dá)蛋白生物學(xué)功能。構(gòu)建高遷移率族蛋白 B1（HMGB1）基因RNAi慢病毒表達(dá)載體，利用三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)生產(chǎn)shRNA-HMGB1病毒，收集病毒上清，并感

4、染 HeLa細(xì)胞，建立穩(wěn)定干擾 HMGB1表達(dá)的pORF5-HeLa細(xì)胞系及空白載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞系；采用qRT-PCR和Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC-3的表達(dá)；采用流式細(xì)胞儀檢測檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。本實驗研究結(jié)果如下：1.成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)pORF5的HeLa細(xì)胞系和對照細(xì)胞系；2.采用 iTRAQ標(biāo)記結(jié)合2D LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)共鑒定了314個差異表達(dá)的宿主蛋白，其中159個蛋

5、白表達(dá)上調(diào)，155個蛋白表達(dá)下調(diào)。GO功能注釋顯示：差異蛋白的功能主要涉及分子功能、細(xì)胞組分功能和生物學(xué)進程功能三方面。分子功能方面包括：①蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子功能，如核仁磷酸蛋白、RNA聚合酶Ⅱ激活因子p15等；②核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子功能，如高遷移率族蛋白B1、高遷移率族蛋白B2等。細(xì)胞組分功能方面包括：①參與細(xì)胞分裂增殖，如氯離子通道蛋白1、膜聯(lián)蛋白A1等；②參與細(xì)胞連接，如α-輔肌動蛋白-4、整合蛋白α-6等。在生物學(xué)進程功能方面：部分差

6、異蛋白參與細(xì)胞繁殖過程，如運鐵蛋白受體蛋白-1、60S酸性核糖體蛋白 P2等；部分差異蛋白參與細(xì)胞免疫反應(yīng)過程，如補體 C9、補體衰退加速因子等；部分差異蛋白參與細(xì)胞死亡，如角蛋白、抑制蛋白-1等。STRING軟件分析結(jié)果顯示：各差異表達(dá)蛋白之間存在著直接和間接的相互作用。KEGG通路分析結(jié)果顯示：差異蛋白與多條信號通路相關(guān)，主要涉及了核糖體通路、剪接體通路、ECM受體相互作用通路、MAPK信號通路和p53信號通路等；3. qRT-PC

7、R證實pORF5-HeLa細(xì)胞中PARK7、HMGB1、HMGB2、HBA1和HIST1H1C表達(dá)上調(diào)，CDKN2A、SFN、KRT7、CLIC1表達(dá)下調(diào)，Western blotting進一步驗證HMGB1和PARK7蛋白質(zhì)在pORF5-HeLa細(xì)胞表達(dá)水平升高，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致；4.與對照細(xì)胞比較，穩(wěn)定干擾HMGB1的pORF5-HeLa細(xì)胞的自噬蛋白Beclin-1和LC-3 mRNA表達(dá)明顯降低，分別降低了62％和89.8%

8、。Western blotting結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞比較，穩(wěn)定干擾HMGB1的pORF5-HeLa細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1明顯下降；LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比率小于對照組，LC3-Ⅱ表達(dá)降低。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示穩(wěn)定干擾HMGB1的pORF5-HeLa細(xì)胞的凋亡率明顯增加，增加了18.84%；細(xì)胞周期也發(fā)生了改變，G2和S期細(xì)胞分別增加了4.44%和3.4%。本實驗研究結(jié)果表明：1.成功構(gòu)建pORF5所引起的宿主差異表達(dá)蛋白數(shù)