沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白致小鼠生殖道炎癥反應及其免疫機制初步研究.pdf

1、目的：沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一種嚴重危害人類健康的病原體，過度的炎癥反應造成免疫病理損傷是Ct主要的致病機制。Ct唯一的一種分泌性質(zhì)粒蛋白pORF5在Ct炎癥反應中可能發(fā)揮重要作用。本實驗研究pORF5質(zhì)粒蛋白是否能引起B(yǎng)ALB/c小鼠生殖道炎癥反應，以及對炎癥細胞因子（CKs）TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響，為進一步研究pORF5質(zhì)粒蛋白的致病機制及防治提供實驗依據(jù)。
　　方

2、法：重組質(zhì)粒 pGEX-6p-1/pORF5經(jīng) PCR和雙酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化XL1-blue大腸桿菌，IPTG誘導表達GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白經(jīng)Glutathione Sepharose4B純化和PreScission Protease切割GST標簽后得到目的蛋白pORF5，SDS-PAGE和Western-Blot進行分析和鑒定；采用快速凍干的方法濃縮pORF5蛋白，用BCA試劑盒測定該蛋白濃度。將pORF5蛋白分別在第1d

3、、3d、6d接種于BALB/c小鼠陰道后穹窿，第7d處死小鼠，HE染色觀察輸卵管組織病理形態(tài)學改變，常規(guī)血細胞計數(shù)法計數(shù)外周血和陰道灌洗液中白細胞總數(shù)，瑞氏染色對外周血和陰道灌洗液中白細胞進行分類計數(shù)；ELISA方法檢測血清、陰道灌洗液和小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平；MTT法檢測脾淋巴細胞增殖反應。
　　結(jié)果：
　　1.重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/pORF5在XL1-blue菌中高效表達出Mr約

4、為54kDa的GST-pORF5融合蛋白，主要以可溶性的形式存在；融合蛋白經(jīng) Glutathione Sepharose4B純化和PreScission Protease切割GST標簽后得到高純度的目的蛋白pORF5；經(jīng)濃縮后濃度達到3μg/μL。
　　2. pORF5蛋白刺激組BALB/c小鼠輸卵管壺腹部與峽部出現(xiàn)不同程度的腫脹，輸卵管周圍的結(jié)締組織發(fā)生黏連，輸卵管單側(cè)或雙側(cè)發(fā)生了不同程度的扭曲、變形、阻塞與積水；而正常組與PB

5、S組小鼠輸卵管壺腹部及峽部未見腫脹，管腔內(nèi)未見積水；pORF5蛋白刺激組小鼠的輸卵管出現(xiàn)中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，PBS對照組與正常組BALB/c小鼠輸卵管的炎癥反應并不明顯。pORF5組的BALB/c小鼠外周血中白細胞總數(shù)較正常組（P﹤0.05）與PBS組（P﹥0.05）均增多，pORF5組的中性粒細胞百分比高于正常組（P﹤0.05）與PBS組（P﹥0.05），淋巴細胞百分比低于正常組（P﹤0.05）與PBS組

6、（P﹥0.05），單核細胞百分比高于正常組（P﹥0.05）與PBS組（P﹥0.05）；pORF5組的BALB/c小鼠陰道分泌物中白細胞總數(shù)較正常組（P﹤0.05）與PBS組（P﹥0.05）均增多。
　　3. pORF5組的BALB/c小鼠外周血中TNF-α水平顯著高于正常組和PBS組（P﹤0.01），IL-1β水平顯著高于正常組和PBS組（P﹤0.01），IL-6水平顯著高于正常組（P﹤0.01）和PBS組（P﹤0.05）；pOR

7、F5組的BALB/c小鼠陰道分泌物中TNF-α水平顯著高于正常組和PBS組（P﹤0.01），IL-1β水平顯著高于正常組和PBS組（P﹤0.05），IL-6水平顯著高于正常組和PBS組（P﹤0.01）。
　　4. pORF5組的BALB/c小鼠脾細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著高于正常組和PBS組（P﹤0.01）；pORF5組BALB/c小鼠脾淋巴細胞經(jīng)pORF5蛋白刺激后的增殖活性較正常組和PBS組（P﹤0.01