SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性與河南漢族人群男性不育的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定，育齡夫婦正常性生活一年以上，并且在未采取任何避孕措施的條件下，仍然無法生育的稱為不孕癥。雖然成功受孕但因各種原因?qū)е铝鳟a(chǎn)、死胎而依然不能使嬰兒最終存活的也一并稱為不育癥。一般把婚后2年以上由于男性方面原因造成女方不孕者稱為男性不育癥。近年來由于環(huán)境污染以及遺傳因素的影響，不孕不育癥已經(jīng)與心血管疾病、腫瘤并列成為影響當(dāng)今人類生活健康的三大主要疾病。近來，越來越多的育齡夫婦遭受到男性

2、不育的困擾。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，已婚夫婦中有10％—15%的夫婦為不孕不育，其中由男性原因引起的約占30%—50%。男性不育癥主要表現(xiàn)在生精障礙方面，病因多且復(fù)雜，如外傷、梗阻、睪丸發(fā)育不良、生殖系統(tǒng)感染、內(nèi)分泌或免疫性疾病、服用激素藥物或腫瘤藥物、不良生活習(xí)慣、環(huán)境毒物以及遺傳因素等等。另有少數(shù)導(dǎo)致男性不育的原因并不能給出基于分子水平的合理解釋，被稱為特發(fā)性男性不育，這其中約有50﹪是由遺傳因素造成的。大量研究發(fā)現(xiàn)，男性不育與染色體異常、

3、Y染色體微缺失及相關(guān)基因的突變均有很高的相關(guān)性。
　　1976年，Tiepol等人發(fā)現(xiàn)存在Y染色體長臂遠(yuǎn)端微缺失的現(xiàn)象有6例患者，繼而猜測在該區(qū)域可能存在控制精子發(fā)生的相關(guān)基因，因此將此區(qū)域命名為無精子癥基因即AZF。更多的學(xué)者隨后投身于對該區(qū)域的研究從而得出結(jié)論AZF區(qū)微缺失與生精障礙有重要關(guān)系?；谶@一結(jié)論，如欲研究基因多態(tài)性與男性不育的相關(guān)關(guān)系，須先排除Y染色體AZF區(qū)微缺失的影響。
　　L.Lazaros等對希臘人群

4、進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體基因的(CAG)n和SHBG（Sex hormone binding globulin,SHBG）基因的(TAAAA)n的重復(fù)數(shù)目在精子的發(fā)生中起著很大的作用，并進(jìn)一步影響了精子的存活數(shù)以及存活質(zhì)量。Mohammad Reza Safarinejad等研究發(fā)現(xiàn)SHBG基因與男性少弱精癥有關(guān)。
　　有研究在人類肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞中進(jìn)行體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攜帶較長重復(fù)等位基因(TAAAA) n的個(gè)體SHBG水平顯著低

5、于攜帶較短重復(fù)等位基因的個(gè)體，說明SHBG啟動子的轉(zhuǎn)錄活性可能與(TAAAA) n重復(fù)數(shù)有關(guān)。Cousin[40][13]等人的研究指出，在法國多毛女性人群中，含有6個(gè)的患者與含有9個(gè)的患者相比，其血清的 SHBG水平較高，而含有8個(gè)的患者其血清的 SHBG水平位于前兩者之間。Vanbillemont等也進(jìn)行了研究，得出結(jié)論攜帶6次（TAAAA） n重復(fù)數(shù)的男性血清SHBG濃度比未攜帶者血清中SHBG的濃度高，并且指出純合子比雜合子擁有

6、更高的血清SHBG水平。在2007年Ferk等人經(jīng)過大量研究也得出相似的結(jié)論：無論是多囊卵巢綜合征患者還是健康成年女性，凡攜帶長等位基因（TAAAA）n的個(gè)體都表現(xiàn)出較低的SHBG水平。
　　近年來許多研究表明，SHBG水平和男性不育有相關(guān)性。Wood等研究發(fā)現(xiàn)，不同長度（TAAAA）重復(fù)等位基因攜帶者的SHBG水平不同，繼而影響男性精子發(fā)生和精液質(zhì)量；Eriksson AL等把（TAAAA）重復(fù)數(shù)作為連續(xù)參數(shù)進(jìn)行分析，研究表明在

7、青年及老年男性中，（TAAAA）等位基因重復(fù)數(shù)和男性SHBG水平間存在相關(guān)性；2008年L.Lazaros等人報(bào)道指出SHBG基因多態(tài)性與男性精液質(zhì)量有關(guān)。2010年Reza Safarinejad等人發(fā)現(xiàn)，SHBG基因（TAAAA）n多態(tài)性和Asp327Asn多態(tài)性與循環(huán)血液中SHBG的濃度及自發(fā)性男性不育有相關(guān)關(guān)系。而關(guān)于SHBG基因啟動子中（TAAAA）n重復(fù)多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性研究國內(nèi)未見報(bào)道。
　　故本課題擬對SHB

8、G基因啟動子（TAAAA）n多態(tài)性進(jìn)行研究，分析其多態(tài)性與河南漢族人群男性不育是否存在相關(guān)關(guān)系。首先本課題為研究對象進(jìn)行Y染色體AZF區(qū)域微缺失檢測，采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Mutiplex Polymerase chain reaction Mutiplex PCR）技術(shù)，以AZF微缺失作為排除標(biāo)準(zhǔn)，對納入的研究對象利用變性聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)對河南漢族人群SHBG基因的啟動子（TAAAA）n多態(tài)性進(jìn)行相關(guān)分析，擬找出其多態(tài)性在河南

9、漢族人群中的分布情況，進(jìn)而得出其與男性不育的相關(guān)性，能更好的為男性不育的臨床檢測與治療提供準(zhǔn)確可靠的理論依據(jù)。
　　研究對象：
　　1．病例組
　　采集自2013年1月—2013年6月因不孕不育問題來鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心及檢驗(yàn)科門診就診的288例患者，年齡在22-45歲（平均年齡32.4±6.4歲）的男性。經(jīng)過正規(guī)檢查，排除肝臟腎臟疾病、慢性病如糖尿病高血壓、睪丸因素疾病、染色體異常及缺失、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、生殖

10、器相關(guān)疾病等病癥以及服用抗腫瘤藥物等情況,要求患者均經(jīng)過至少兩次精液常規(guī)檢查，并且是按照標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程進(jìn)行的,經(jīng)確診為無精子或少精子病的患者作為研究對象(精子密度＜20×106/mL)。所有受試者均為河南地區(qū)漢族人，且同意并已簽署知情同意書。
　　2．對照組
　　隨機(jī)抽取正常生育至少一個(gè)孩子并且身體健康無肝腎、糖尿病、高血壓等的男性血液樣本259例做為正常對照組，年齡在24-45歲（平均年齡32.8±6.7歲），對象均為河南

11、地區(qū)漢族人，且均已簽署知情同意書。另以無菌雙蒸水作為空白對照。
　　研究方法：
　　采用常規(guī)經(jīng)典的酚-氯仿法，分別從病例組的血液和對照組的血液中提取DNA，PCR擴(kuò)增目的片段，進(jìn)行Y染色體微缺失檢測，再用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對無缺失樣本的目的片段進(jìn)行SHBG基因啟動子（TAAAA）n基因型的檢測，觀察并記錄分析。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
　　采用χ2檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較病例組和對照組由于基因型、等位基因頻率等

12、相關(guān)因素在其中的分布差異性而男性不育的相關(guān)危險(xiǎn)度則采用比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)來表示并嚴(yán)格控制其他干擾因素因素對結(jié)果的影響。使用HWE軟件檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡對于對照組和病例組的基因型分布是否足以用樣本代表總體。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn),概率以P＜0.05作為顯著性差異指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS17.0和HWE1.20。
　　結(jié)果：

13、r>　　1．病例組288例中檢測出35例Y染色體微缺失，缺失率為12.15%。對照組中未檢出。
　　2．檢測到(TAAAA)5～10次重復(fù)6個(gè)等位基因及5/5、5/6、5/7、5/8、5/9、6/6、6/7、6/8、6/9、6/10、7/7、7/8、7/9、7/10、8/8、8/9、8/10、9/9、9/10、10/10等20種基因型
　　3．在病例組和對照組中，樣本的SHBG基因型頻率都符合Hardy-Weinberg平衡

14、，表明選取樣本可靠，其具有很好的代表性。
　　4．SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性中等位基因頻率差異在病例組和對照組的對比中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5．SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性研究中，當(dāng) n=5、6、7、10時(shí)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0083）;n=9為危險(xiǎn)因素（P＜0.0083，OR=1.68，95%CI：1.30-2.17）；n≥9時(shí)顯著增加了不育的風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.01，OR