ESR2基因多態(tài)性與河南漢族人群男性不育的相關(guān)性分析.pdf

1、研究背景和目的:
　　由世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定，夫婦生活1年以上并且沒有采用任何避孕措施，仍然無法生育的稱為不孕不育，由男方因素造成的稱為不育癥。近年來，不孕不育的比例在已婚的適齡夫婦中越來越高，并且，不孕不育給社會帶來了很多負(fù)面影響。男性不育癥中，病因很多并且相當(dāng)復(fù)雜，比如外傷、睪丸發(fā)育不良、內(nèi)分泌或免疫性疾病、梗塞、服用激素藥物或腫瘤藥物、環(huán)境毒物、不良生活習(xí)慣以及遺傳因素等等。還有少數(shù)男性不育不能給出基于分子水平的合理解

2、釋，被稱為特發(fā)性男性不育，這其中約有50％是由遺傳因素造成的。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常、Y染色體微缺失及相關(guān)基因的突變都與男性生殖能力的改變有關(guān)。
　　越來越多的學(xué)者驗證了Y染色體長臂遠端AZF區(qū)域微缺失與精子發(fā)生障礙有重要關(guān)系。基于這一結(jié)論，要想研究相關(guān)基因多態(tài)性與男性生殖能力的相關(guān)關(guān)系，必須先排除Y染色體AZF微缺失的影響。
　　1996年，Mosselman等人首次從睪丸組織中克隆出了雌激素受體的另一種亞型，雌

3、激素受體β（Estrogen receptorβ）后來被稱為ERβ即ESR2。研究發(fā)現(xiàn)，ESR2基因rs4986938G/A位點位于ESR2基因的第8外顯子的3'非編碼區(qū)第1730號核苷酸處。而rs1256049G/A位點則位于ESR2基因的第5外顯子的配體結(jié)合區(qū)的第1082號核苷酸處。2010年，Mohammad Reza Safarinejad等人對伊朗人群ESR2基因這兩個位點多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，單倍型與男性不育有關(guān)

4、系。2011年臺灣學(xué)者Wen Lee等人的研究發(fā)現(xiàn)，ESR2基因的rs4986938、rs1256049位點的多態(tài)性與精液濃度有關(guān)，rs1256049位點的多態(tài)性還與精子運動能力有關(guān)。2012年日本學(xué)者Tsutomu Ogata等對ESR2基因的多個SNPs位點多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性研究中顯示，單倍型“TGTAGA”可能是男性不育的風(fēng)險單倍型，但其中rs1256049位點的等位基因G/A在病例組和對照組中的頻率分布沒有顯著差異。目前，

5、ESR2基因多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性在不同研究報道中的結(jié)果不盡相同，并且國內(nèi)沒有這方面研究的相關(guān)報道，故本研究選取ESR2基因的rs4986938、rs1256049位點進行研究，擬分析ESR2基因多態(tài)性與河南漢族人群男性不育是否相關(guān)。
　　本研究首先用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Mutiplex Polymerase chain reactionMutiplex PCR)對研究對象的病例組進行了Y染色體AZF區(qū)域微缺失的檢測，排除AZF

6、微缺失之后，對病例組剩下的研究對象再利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)邛艮制性片段多態(tài)性（Polymerase chain reaction restriction-fragment length polymorphism,PCR-RFLP）技術(shù)對河南漢族人群ESR2基因的rs4986938位點和rs1256049位點多態(tài)性進行分析，擬研究這兩個位點多態(tài)性在河南漢族人群中的分布情況及其與男性生殖能力的相關(guān)性，從而為男性不育的臨床檢測與治療提供相關(guān)理論依

7、據(jù)。
　　研究對象:
　　病例組
　　收集2012年11月到2013年3月來鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診檢驗科就診的397例不育癥患者的精液標(biāo)本，患者年齡22-42歲（平均年齡29.4±6.1歲）。患者均根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)進行常規(guī)精液分析，并且連續(xù)三次檢查確診為無精子癥、少精子癥（精子密度＜20×106/ml）。患者均排除生殖器手術(shù)、睪丸炎、精索靜脈曲張、內(nèi)分泌疾病、肝腎類疾病、染色體異常、生殖器異常等情況。<

8、br>　　對照組
　　隨機選取通過正常手段生育至少一個健康孩子的健康男性347例作為對照組，年齡22-42歲（平均年齡31.7±2.6歲）。
　　所有病例組和對照組的研究對象均來自河南地區(qū)，飲食結(jié)構(gòu)大致相同，并且都知情同意。
　　研究方法:
　　抽取精液用經(jīng)典的酚-氯仿方法提取基因組DNA，PCR擴增目的片段，再經(jīng)過RsaⅠ和AluⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，最后用2.5％的瓊脂糖凝膠電泳對擴增片段和酶切片段進行基因型檢

9、測，紫外分析凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。
　　統(tǒng)計學(xué)處理:
　　所有得到的數(shù)據(jù)都采用SHEsis在線軟件和SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，檢驗水準(zhǔn)為:α=0.05。病例組和對照組均使用SHEsis在線軟件進行Hardy-Weinberg(HWE)檢測，以估計所選資料的人群代表性。使用SPSS17.0計算OR值以及95％置信區(qū)間，進行基因突變對男性不育發(fā)生的風(fēng)險性估計。用在線軟件SHEsis進行單倍型分析。
　　結(jié)果:

10、>　　1.檢測出397例病例組中有50例Y染色體微缺失。
　　2.河南漢族人群中，ESR2基因的rs4986938以及rs1256049位點基因型頻率都符合Hardy-Weinberg平衡，表明其具有良好的人群代表性。
　　3.本研究中，rs4986938位點在患者組和對照組對比中，基因型和等位基因頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.對rs4986938位點進行的密度分組分析中，GG基因型在重度少精和輕度

11、少精組間差異顯著(P＜0.05)。
　　5.在本研究中，對于rs1256049位點兩組之間的對比顯示:基因型和等位基因頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.對rs1256049位點進行的密度分組分析，GG基因型在重度少精和極重、無精組間差異顯著(P＜0.05)。
　　7.在河南漢族人群中，對rs4986938 G/A和rs1256049 G/A兩個位點在男性不育組與正常對照組間進行單倍型分析，發(fā)現(xiàn)A-G、G

12、-A、G-G單倍型在兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.ESR2基因rs4986938位點的A等位基因與rs1256049位點的A等位基因可能均是河南漢族人群男性不育的遺傳危險因子。
　　2.ESR2基因rs4986938和rs1256049位點的A-G/G-A單倍型可能是河南漢族人群男性不育的風(fēng)險單倍型，G-G單倍型是男性不育的保護單倍型。
　　3.ESR2基因多態(tài)性可能與河南漢族男