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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
探究肝癌細(xì)胞下調(diào)IGF-1活性的分子機(jī)制,并且闡述IGF-1與B淋巴細(xì)胞在Ras癌基因誘導(dǎo)肝腫瘤發(fā)生過程中的扮演的角色及二者的關(guān)系。
方法:
1、提取9月齡H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄鼠肝腫瘤組織(T)、腫瘤周圍組織(P)以及9月齡非轉(zhuǎn)基因雄鼠肝組織(Wt)樣本,分別進(jìn)行病理分析和總蛋白質(zhì)以及總RNA的提取;應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織樣本中p-ERK、ERK、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白
2、表達(dá);熒光定量PCR檢測(cè)IGFBP1、IGFBP3、GHR、IGF-1在組織樣本中的mRNA表達(dá)水平;酶聯(lián)免疫分析雄鼠血清中IGF-1、IgG1和IgG2水平。
2、采用流式細(xì)胞法(FCM)分別檢測(cè)3、5和9月齡H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄性小鼠及對(duì)照組正常C57BL/6J雄性小鼠的外周血中淋巴細(xì)胞比例和活性水平,同時(shí)對(duì)所有小鼠的肝組織進(jìn)行病理學(xué)診斷。
結(jié)果:
1、蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,p-ERK的蛋白
3、水平檢測(cè)表明:T組織中的p-ERK蛋白水平為21.09±6.57,比Wt組織的0.08±0.02顯著升高,t=5.80,P=0.004,比P組織的8.42±3.21也顯著升高,t=4.95,P=0.005,P組織比Wt組織顯著升高,t=3.75,P=0.042; ERK的蛋白水平檢測(cè)表明:T組織中的ERK蛋白水平為15.98±1.94,比Wt組織的4.72±1.00顯著升高,t=4.02,P=0.029,比P組織的4.55±1.12也顯
4、著升高,t=4.92,P=0.005;P-PI3K的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明:T組織中的P-PI3K蛋白水平為0.47±0.02,比Wt組織的0.06±0.00顯著升高,t=9.02,P=0.008,比P組織的0.34±0.05也顯著升高,t=3.09,P=0.042,P組織的比Wt組織的顯著升高,t=3.32,P=0.045;PI3K的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明:T組織中的PI3K蛋白水平為0.78±0.11,比Wt組織的0.03±0.00顯著
5、升高,t=11.05,P<0.001,比P組織的0.29±0.08也顯著升高,t=3.96,P=0.029,P組織的比Wt組織的顯著升高,t=3.42,P=0.016; p-AKT的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明:T組織中的p-AKT蛋白水平為0.23±0.05,比Wt組織的0.11±0.02顯著升高,t=3.89,P=0.037;AKT的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明:T組織中的AKT蛋白水平為0.18±0.04,比Wt組織的0.06±0.03顯著升高,
6、t=2.87,P=0.042,P組織中的AKT蛋白水平為0.23±0.06,比Wt組織的也顯著升高,t=4.92,P=0.010;熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,IGFBP1和IGFBP3 mRNA水平在腫瘤組織中顯著性升高;IGF-1和GHR在腫瘤組織中顯著性降低;酶聯(lián)免疫分析結(jié)果顯示,9月齡轉(zhuǎn)基因雄鼠血清中IGF-1水平(1.27±0.35)較同月齡對(duì)照組(1.90±0.34)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,t=-4.225,P=0.020;9
7、月齡轉(zhuǎn)基因雄鼠血清中IgG1水平(39.91±4.86)較同月齡對(duì)照組(49.65±7.14)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,t=-3.845,P=0.011;9月齡轉(zhuǎn)基因雄鼠血清中IgG2水平(28.80±2.45)較同月齡對(duì)照組(34.86±4.29)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,t=-3.024,P=0.006。
2、3月齡的H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄性小鼠和3、5和9月齡的對(duì)照組雄性小鼠的肝臟均未出現(xiàn)顯著的病理學(xué)變化。5月齡的H-ra
8、s12V轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的肝臟中出現(xiàn)多發(fā)性結(jié)節(jié),而9月齡的H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的肝臟則發(fā)生了多發(fā)性肝腫瘤。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠的其他組織器官無(wú)顯著病理變化。對(duì)于B淋巴細(xì)胞,與同月齡的正常C57BL/6J雄性小鼠相比,3、5和9月齡H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的外周血中B淋巴細(xì)胞所占的比例(sIgM+CD23+和sIgM+B220+)顯著降低(P<0.01),活性B淋巴細(xì)胞(CD19+CD69+)所占的比例在5和9月齡也都顯著降
9、低(P<0.05)。并且隨著月齡的增加及H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄性小鼠肝腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,外周血B淋巴細(xì)胞和活性B淋巴細(xì)胞的比例呈逐漸降低趨勢(shì)。對(duì)于T淋巴細(xì)胞,與同月齡正常C57BL/6J雄鼠相比,3、5月齡H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄鼠的外周血T淋巴細(xì)胞(CD3e+)比例及活性T淋巴細(xì)胞(CD3e+CD69+、CD3e+CD25+)比例均無(wú)顯著差異(P>0.05),但9月齡H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄鼠的外周血T淋巴細(xì)胞比例及活性T淋巴細(xì)胞比
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