吲哚胺2,3-雙加氧酶在哮喘小鼠肺組織的表達(dá)及意義.pdf

1、支氣管哮喘（Bronchial asthma）是全世界最常見的慢性呼吸道疾病之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]，嚴(yán)重威脅著兒童健康。哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，既往研究認(rèn)為與Th1亞群功能減弱，Th2亞群功能增強(qiáng)有關(guān)，最近研究發(fā)現(xiàn)一種獨(dú)立于Th1、Th2細(xì)胞存在的輔助性T淋巴細(xì)胞即Th17，參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)，“免疫耐受”在哮喘發(fā)病機(jī)制中的地位越來(lái)越受到重視，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)表明，誘導(dǎo)哮喘免疫耐受形成可能成為哮喘防治的新靶點(diǎn)。吲哚胺2，3

2、-雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)是一種免疫調(diào)節(jié)酶，可介導(dǎo)機(jī)體的免疫抑制反應(yīng)，在誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受中發(fā)揮重要作用。IDO是將色氨酸分解代謝的限速酶，可在局部組織中形成低色氨酸的環(huán)境[3]。IDO沿著犬尿氨酸途徑將色氨酸降解成L-犬尿氨酸、3-羥基犬尿氨酸、尼克酰酸等一系列的代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用[4]。IDO在自身免疫性疾病、器官移植、腫瘤、妊娠過(guò)程中保護(hù)胎兒免遭母體排斥等方面研究較多，而在支氣管哮喘發(fā)

3、病機(jī)制中的研究較少，故我們建立塵螨哮喘小鼠模型，探討IDO在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　在致敏原選擇方面，本課題組既往均是采用卵清蛋白（OVA）作為變應(yīng)原建立哮喘模型，但存在一定的缺陷，而塵螨是哮喘最常見的變應(yīng)原之一，以塵螨制作的哮喘模型與人類哮喘的病變過(guò)程相似，能更好的模擬哮喘發(fā)病機(jī)制中各種炎性因子、組織結(jié)構(gòu)的變化。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立塵螨哮喘小鼠模型，觀察小鼠病理學(xué)、支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage

4、fluid BALF）中炎癥細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)血清及BALF液中IL-17和IFN-γ水平、肺組織中IDO蛋白的表達(dá)，探討IDO在哮喘發(fā)病中的作用及與IL-17、IFN-γ的關(guān)系，以期從免疫耐受方面著手，為支氣管哮喘的免疫治療拓寬思路，尋找哮喘治療中的新靶點(diǎn)。
　　目的
　　檢測(cè)哮喘小鼠肺組織內(nèi)IDO的表達(dá)水平，探討哮喘小鼠肺組織中IDO的表達(dá)與血清、BALF中IL-17、IFN-γ水平之間的關(guān)系及布地奈德對(duì)其的影響，以及IDO在

5、支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中對(duì)免疫耐受的影響及意義。
　　材料和方法
　　1實(shí)驗(yàn)小鼠分組和哮喘模型制作方法
　　SPF級(jí)、健康、6周齡、雌性BALB/c小鼠21只(購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（豫）20100002)。實(shí)驗(yàn)前稱重，依隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)小鼠分為對(duì)照組、哮喘組、布地奈德干預(yù)組，每組7只制備動(dòng)物模型。致敏階段：哮喘組及干預(yù)組：第1天皮下注射2000 U/m l塵螨提取液100μl,第3、5、7天腹腔注射2

6、000 U/m l塵螨提取液100μl共3次,第9、11、13天腹腔注射4000 U/m l塵螨提取液50μl共3次（注：每ml塵螨提取液中氫氧化鋁含2％）；對(duì)照組則用相同致敏方法、同等劑量的生理鹽水替代致敏小鼠；激發(fā)階段：第15、16、17天，用4000 U/m l塵螨提取液50μl/次，緩慢滴鼻,1次/d，滴鼻前以0.3%戊巴比妥0.3m l腹腔注射麻醉小鼠。干預(yù)組：每次激發(fā)前，給予布地奈德混懸液lmg（2ml）霧化吸入30分鐘，余

7、同哮喘組；對(duì)照組：用同等劑量的生理鹽水滴鼻激發(fā)。
　　2小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)及肺組織標(biāo)本處理
　　各組小鼠均在末次滴鼻激發(fā)24h后，0.3%戊巴比妥0.3 ml腹腔注射麻醉動(dòng)物后，立即取眼球放血，收集血液于EDTA抗凝管中，3000r/min離心10min，取血清于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；迅速剝離肺，結(jié)扎左肺根，取左肺作為標(biāo)本，置于-80℃冰箱中，留做Western bolt蛋白印跡，以24G靜脈留置套管針行右支氣管插管并進(jìn)行

8、灌洗，以1mL注射器抽吸0.8mL生理鹽水注入氣管，停留30秒后回抽，重復(fù)灌洗3次，最后可回抽出1.0-1.8mL的生理鹽水，回收率＞80%，轉(zhuǎn)移至EP管中，以3000r/min將肺泡灌洗液離心10min，取上清液用于細(xì)胞因子檢測(cè)，細(xì)胞沉淀經(jīng)100ul生理鹽水重懸后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)，取右肺組織，雙蒸水沖洗甲醛固定后石蠟包埋切片，分別行HE染色及免疫組化染色。
　　3 HE染色
　　取甲醛固定過(guò)的右肺組織，制備蠟塊、

9、切片、烤片，然后脫蠟、水化，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色等，制備成HE染色玻片，在顯微鏡下觀察同等級(jí)別支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況及支氣管壁形態(tài)學(xué)改變和測(cè)定同等級(jí)別的支氣管壁厚度（制作過(guò)程嚴(yán)格按HE染色法步驟操作）。
　　4免疫組化染色
　　將小鼠肺組織石蠟切片、烘烤，自然冷卻，經(jīng)固定水、石蠟包埋、冰凍切片，制成3μm厚的切片。放入二甲苯溶液中重復(fù)脫蠟2次、脫水、加入抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、加入1：100的nIDO一

10、抗，孵育，4℃過(guò)夜；滴加二抗、孵育、而后脫水封片等，制作時(shí)嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色步驟操作。應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)，在顯微鏡高倍鏡（10×40）下觀察并測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。每張切片隨機(jī)擇取5個(gè)高倍鏡視野范圍，結(jié)果以其平均值單位面積累積光密度(IOD)值表示。
　　5 ELISA法檢測(cè)血清及BALF液中IL-17、IFN-γ水平
　　將保存于-20℃冰箱的小鼠血清及BALF上清液取出，嚴(yán)格按照IL-17、IFN-γE

11、LISA試劑盒說(shuō)明書操作。
　　6 Western blot蛋白印跡法檢測(cè)IDO蛋白表達(dá)
　　取-80℃冰箱凍存的小鼠左肺組織，稱取肺組織重量1g，加入組織蛋白抽提試液提取蛋白，用預(yù)冷的勻漿研磨器處理1-2min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)，置于冰上孵育30min，離心15-20分鐘，收集上清，-20℃保存。考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行蛋白定量，分裝，-20℃冰箱保存，配制15%的聚丙烯酸胺凝膠，將溶液注入玻璃板夾層

12、中，至少聚合30min，100℃水浴5min、離心5min，加點(diǎn)樣孔和蛋白Marker，然后電泳?？捡R斯亮藍(lán)R-250、麗春紅染色液進(jìn)行染色，在搖床上脫色至蛋白條帶清晰，將膠浸入事先準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后脫脂奶粉封閉，室溫?fù)u床上緩慢搖動(dòng)2 h，然后置于10mL1:1000脫脂奶粉稀釋的一抗中，4℃過(guò)夜，棄去帶有一抗的封閉液，行二抗孵育，然后曝光顯影。
　　7統(tǒng)計(jì)分析
　　應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分

13、析。各組數(shù)據(jù)分析以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間樣本均數(shù)差異性比較則采用單因素方差分析，LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，兩個(gè)因素之間采用Pearson相關(guān)性分析，α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果
　　1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察
　　哮喘組小鼠經(jīng)過(guò)塵螨提取液反復(fù)滴鼻激發(fā)后，出現(xiàn)明顯呼吸急促、頭面部瘙癢、前肢縮抬、弓背、煩躁等哮喘急性發(fā)作表現(xiàn)，非激發(fā)期有飲水、排便等增加。布地奈德干預(yù)組也出現(xiàn)與哮喘組相似的癥狀，但表現(xiàn)較哮喘組

14、輕。對(duì)照組小鼠呼吸平穩(wěn)，行為和飲食均未見異常。
　　2小鼠肺組織病理學(xué)改變
　　哮喘組小鼠：氣道壁厚度增加，氣道上皮細(xì)胞脫落、杯狀細(xì)胞化生、膠原纖維增生，可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主。干預(yù)組小鼠：氣道炎癥與哮喘組相似，但程度明顯較輕。對(duì)照組小鼠：氣道壁厚度正常，無(wú)杯狀細(xì)胞化生，可見散在炎癥細(xì)胞、管腔無(wú)狹窄。3組小鼠氣道壁厚度示哮喘組較干預(yù)組及對(duì)照組增高，干預(yù)組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

15、。（見附圖4.1，見表4.1）
　　3支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類
　　結(jié)果顯示哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)與干預(yù)組、對(duì)照組相比明顯升高，干預(yù)組高于對(duì)照組，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見表4.2）
　　4各組小鼠肺組織IDO免疫組化結(jié)果
　　免疫組化顯示褐色區(qū)為陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)。結(jié)果顯示IDO主要存在于小鼠支氣管壁、小血管壁周圍，陽(yáng)性區(qū)積分光密度平均值顯示哮喘組IDO表達(dá)低于干

16、預(yù)組和對(duì)照組，干預(yù)組IDO表達(dá)低于對(duì)照組，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見表4.3，圖4.2）
　　5血清及BALF液中IL-17、IFN-γ的水平
　　哮喘組小鼠血清中IL-17水平與干預(yù)組、對(duì)照組相比升高，干預(yù)組高于對(duì)照組，（F=65.15 P<0.05）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，哮喘組血清中IFN-γ水平較干預(yù)組和對(duì)照組降低，干預(yù)組低于對(duì)照組，（F=107.31 P<0.05）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小鼠BALF中I

17、L-17水平哮喘組高于干預(yù)組和對(duì)照組，干預(yù)組較對(duì)照組升高，（F=22.23，P＜0.05）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3組小鼠BALF中IFN-γ水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，哮喘組（1.53±0.30）較干預(yù)組（3.9±2.88）和對(duì)照組（11.92±4.19）降低，干預(yù)組低于對(duì)照組。（見表4.4、表4.5）
　　6小鼠肺組織中IDO蛋白表達(dá)結(jié)果
　　各組的IDO/內(nèi)參灰度比值分別為:哮喘組、干預(yù)組的蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明

18、顯降低(F=5.31 P<0.01)，干預(yù)組低于對(duì)照組(F=5.31 P<0.01)。（見表4.6，圖4.3）。
　　7相關(guān)性分析
　　Pearson相關(guān)分析顯示：血清中IL-17水平與BALF中IL-17水平呈正相關(guān)（r=0.921，P<0.01），血清中IFN-γ水平與BALF中IFN-γ水平呈正相關(guān)（r=0.981， P<0.01）；血清中IL-17水平與IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.933，P<0.01）；BAL

19、F中IL-17水平與IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.905，P<0.01）；肺組織內(nèi)IDO蛋白的表達(dá)與血清中IL-17水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.916，P<0.01），與血清中IFN-γ水平呈正相關(guān)（r=0.956，P<0.01）；肺組織內(nèi)IDO蛋白的表達(dá)與BALF中IL-17水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.905，P<0.01），與BALF中IFN-γ水平呈正相關(guān)性（r=0.963， P<0.01），見圖4.4-4.11。
　　結(jié)論