吲哚胺2,3-雙加氧酶在非霍奇金淋巴瘤免疫耐受中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：
　　 非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一組起源于淋巴結(jié)或其他淋巴組織的常見(jiàn)惡性腫瘤，病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不甚清，免疫耐受可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。以利妥昔單抗(抗CD20單抗)為代表的針對(duì)淋巴瘤的免疫靶向治療已取得良好療效。但仍存在一個(gè)重要問(wèn)題就是無(wú)法克服腫瘤細(xì)胞形成的免疫耐受，機(jī)體免疫系統(tǒng)無(wú)法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的識(shí)別和殺傷。免疫耐受形成過(guò)程中涉及到的主要細(xì)胞包括：樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，

2、DCs)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryT cells，Tregs)、肥大細(xì)胞、甚至是暏酸性粒細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞亦可直接或間接通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞等誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)部免疫耐受微環(huán)境。因此，研究NHL腫瘤細(xì)胞如何直接或間接通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞形成免疫耐受的腫瘤微環(huán)境，從而針對(duì)性地阻斷腫瘤免疫耐受形成的關(guān)鍵通路，將對(duì)NHL治療起到關(guān)鍵性的輔助作用。
　　 作為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，色氨酸代謝在誘導(dǎo)免疫耐受形成中的作用不斷見(jiàn)諸報(bào)道。吲哚胺2，3-雙加氧酶

3、(Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)是色氨酸代謝中肝臟以外唯一可催化色氨酸分子中吲哚環(huán)氧化裂解，從而沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶；主要表達(dá)于一些免疫耐受或免疫特赦組織中，如胸腺、胃腸道粘膜、附睪、胎盤及眼前房等，并且特異性地表達(dá)在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上。通過(guò)對(duì)小鼠和人DCs的大量研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)IDO的DCs亞群與機(jī)體的免疫耐受密切相關(guān)，如參與誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞失能及活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。研究表明，IDO在腫

4、瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達(dá)，從而被證實(shí)參與了腫瘤的免疫耐受機(jī)制，并在其中發(fā)揮重要作用。以1-甲基色氨酸(1-MT)為代表的IDO抑制劑已在國(guó)外用于Ⅰ期臨床試驗(yàn)，并取得了良好的療效。
　　 研究者發(fā)現(xiàn)，凡是IDO高表達(dá)的部位，如胎盤、腫瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，都存在大量調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞于1995年首次報(bào)道，其中轉(zhuǎn)錄因子FoxP3是Tregs的特異性標(biāo)志，是發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。Tregs同樣在維持自身免疫耐受中起重要作

5、用，其作用已在多種自身免疫、腫瘤模型中得到證實(shí)，而且最新研究顯示Tregs的增殖及活化可能與IDO+DC亞群密切相關(guān)。已有研究證實(shí)：在多種腫瘤、腫瘤細(xì)胞系、急性白血病及成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤中存在著IDO的過(guò)表達(dá)，并通過(guò)對(duì)小鼠淋巴瘤模型的研究證實(shí)了IDO的過(guò)表達(dá)與Tregs增殖存在相關(guān)性。然而IDO上調(diào)Tregs的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。
　　 本課題旨在研究IDO在NHL患者組織水平上的表達(dá)情況，探討其與Tregs的相關(guān)性

6、及其在NHL發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的作用。進(jìn)而通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和建立NHL動(dòng)物模型，驗(yàn)證IDO在NHL腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受中的作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行細(xì)致的研究和探討。為臨床發(fā)掘新的判斷NHL預(yù)后的指標(biāo)，并為IDO抑制劑1-MT的臨床應(yīng)用提供有力的理論支持。
　　 第Ⅰ部分 IDO和FoxP3在人非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)及意義
　　 研究目的：
　　 以人NHL標(biāo)本為研究對(duì)象，探討IDO在NHL中的表達(dá)情況，分析其與臨床特征

7、以及與Tregs的相關(guān)性
　　 研究方法：
　　 1.收集NHL空白石蠟切片(n=57)，以反應(yīng)性增生(n=18)為對(duì)照，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)研究IDO和FoxP3在組織中的表達(dá)及部位。
　　 2.收集NHI_，新鮮標(biāo)本(n=20)，以實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)比較IDO和FoxP3在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　 3.收集NHL新鮮標(biāo)本(n=20)，利用western blot技術(shù)比較IDO和FoxP3在

8、蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析IDO在NHL和反應(yīng)性增生中的表達(dá)差異及其與FoxP3的相關(guān)性。探討IDO與非霍奇金淋巴瘤臨床病例資料如年齡、性別、臨床分期、病理類型、LDH及預(yù)后等因素之間的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組IDO陽(yáng)性細(xì)胞率均在30％以下，而57例NHL石蠟切片中，IDO+NHL(陽(yáng)性細(xì)胞率在30％以上者)為18例(31.58％)。18例IDO+NHL石蠟切片

9、的FoxP3陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組及39例IDONHL切片。IDO-NHL切片的FoxP3陽(yáng)性率與對(duì)照組無(wú)顯著差異。結(jié)合NHL患者臨床病例資料，18例IDO+NHL患者的臨床分期多為Ⅲ或Ⅳ期，而39例IDO-NHL患者臨床分期相對(duì)較早，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IDO+NHL患者LDH值以及腫瘤直徑同樣顯著大于IDO-NHL患者。以上數(shù)據(jù)均提示IDO與NHL預(yù)后密切相關(guān)。
　　 2.20例新鮮NHL標(biāo)本經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定，ID

10、OmRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(2-dCt：0.00582～0.546 v.0～0.0103，P<0.05)。對(duì)于NHL組內(nèi)進(jìn)行IDO與FoxP3mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析，兩者呈正相關(guān)(r=0.447)。
　　 3.20例新鮮NHL標(biāo)本經(jīng)WB測(cè)定，IDO蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(0.77±0.25 vs.0.18±0.18，P<0.05)。NHL組內(nèi)，IDO與FoxP3在蛋白水平上的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.613)。
　　

11、 結(jié)論：
　　 1.部分NHL組織內(nèi)存在IDOmRNA和蛋白高表達(dá)。
　　 2.IDO的高表達(dá)與NHL臨床分期、LDH值等密切相關(guān)，提示IDO可能指示了NHL患者預(yù)后不良。
　　 3.IDO的表達(dá)與FoxP3呈正相關(guān)，推測(cè)IDO+NHL腫瘤細(xì)胞可能與Tregs存在功能上的密切聯(lián)系。
　　 第Ⅱ部分高表達(dá)IDO的淋巴瘤細(xì)胞株對(duì)Tregs調(diào)控作用的研究
　　 研究目的：
　　 以高表達(dá)IDO的

12、小鼠B系淋巴瘤細(xì)胞株A20及小鼠T細(xì)胞為研究對(duì)象，體外混合細(xì)胞培養(yǎng)，證實(shí)高表達(dá)IDO的淋巴瘤細(xì)胞株可上調(diào)Tregs的比例。
　　 研究方法：
　　 1.免疫磁珠技術(shù)(MACS)分離BALB/c小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證其純度。
　　 2.選取高表達(dá)IDO的A20細(xì)胞系(源于BALB/c小鼠)，將IDO+A20細(xì)胞系與BALB/c小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞分為以下三組共同培養(yǎng)：①CD4+C

13、D25-T細(xì)胞組；②CD4+CD25-T細(xì)胞+A20細(xì)胞組；③CD4+CD25-T細(xì)胞+A20細(xì)胞+1-甲基色氨酸組。
　　 3.培養(yǎng)24小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD4+CD25+T細(xì)胞的比例。觀察IDO+腫瘤細(xì)胞以及IDO抑制劑1-MT對(duì)Tregs增殖和功能的影響。
　　 4.MACS技術(shù)收集第②組中培養(yǎng)后的CD4+CD25+T細(xì)胞：MACS技術(shù)分離BALB/c小鼠脾臟中的DCs；Ficoll分離BALB/c小鼠脾臟中的

14、單個(gè)核細(xì)胞(MNC)。分為以下4組進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：①CD4+CD25+Tc+DCs+MNC；②MNC+DCs；③MNC組；④CD4+CD25+Tc組。培養(yǎng)72h后，MTT法測(cè)定其在570nm吸光度值(A值)，計(jì)算CD4+CD25+T細(xì)胞的抑制率(supressive rate，SR)。SR=[1-(A1-A3-A4)/(A2-A3)]×100％
　　 研究結(jié)果：
　　 1.流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證MACS技術(shù)分離得到的CD4

15、+CD25-T細(xì)胞純度在98％以上。
　　 2.混合細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD4+CD25+T細(xì)胞比例：第①組為0；第②組為7.87±1.65％；第③組為3.32±1.19％，證實(shí)高表達(dá)IDO的A20細(xì)胞系可誘導(dǎo)CD4+CD25T細(xì)胞向CD4+CD25+表型轉(zhuǎn)化，而且1-MT可明顯抑制該過(guò)程。
　　 3.MTT法分析測(cè)定轉(zhuǎn)化后CD4+CD25+T細(xì)胞的抑制功能：陽(yáng)性對(duì)照組A值明顯高于陰性對(duì)照組(0.8657±

16、0.0353 vs0.3434±0.0319，P<0.05)，說(shuō)明T細(xì)胞在DCs的作用下增殖、活化；而實(shí)驗(yàn)組A值明顯小于陽(yáng)性對(duì)照組(0.4331±0.0280vs0.8657±0.0353，P<0.05)，證實(shí)轉(zhuǎn)化后的Tregs具有抑制T細(xì)胞增殖的作用(抑制率為82.54±7.31％)。
　　 結(jié)論：
　　 1.A20細(xì)胞系在體外可穩(wěn)定高表達(dá)IDO。
　　 2.免疫磁珠技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的細(xì)胞分離手段，可被廣泛應(yīng)

17、用于臨床和基礎(chǔ)研究中。
　　 3.IDO+腫瘤細(xì)胞可在體外將CD4+CD25+T細(xì)胞向CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的CD4+CD25-T細(xì)胞具有免疫抑制功能。
　　 4.IDO抑制劑1-MT可逆轉(zhuǎn)體外IDO+腫瘤細(xì)胞將CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞的過(guò)程，說(shuō)明這一轉(zhuǎn)化具有IDO依賴性。
　　 第Ⅲ部分動(dòng)物模型的建立及IDO對(duì)Tregs調(diào)控作用的探討
　　 研究目的：

18、　　 通過(guò)NHL動(dòng)物模型，研究IDO+NHL小鼠Tregs在腫瘤、引流淋巴結(jié)及脾臟中的含量以及使用IDO抑制劑1-MT對(duì)Tregs的影響
　　 研究方法：
　　 1.建立NHL動(dòng)物模型：選6-8周齡左右BALB/c小鼠，皮下注射A20細(xì)胞懸液(5×106/只)。
　　 2.1周后選取腫瘤大小相近的小鼠入組實(shí)驗(yàn)，以同周齡的正常BALB/c小鼠為對(duì)照，分為以下三組：正常對(duì)照組(n=6)，腫瘤組(n=6)，1-MT干

19、預(yù)組(n=6)。
　　 3.對(duì)于1-MT干預(yù)組，每R瘤內(nèi)注射1-MT溶液，正常組和腫瘤組注射同體積PBS。
　　 3.2周后處死小鼠，收集腫瘤、脾臟、淋巴結(jié)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Tregs在腫瘤組織、淋巴結(jié)及脾臟中的含量；通過(guò)Western Blot檢測(cè)IDO和FoxP3在組織中的表達(dá)。收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組差異。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.A20 B細(xì)胞淋巴瘤模型成瘤率為95％，成瘤時(shí)間為

20、7天左右。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果
　　 就CD+CD25+T細(xì)胞在腫瘤組織、脾臟、淋巴結(jié)中占淋巴細(xì)胞的比例而言，腫瘤組均明顯高于1-MT干預(yù)組，也明顯高于正常對(duì)照組。
　　 CD4+T細(xì)胞在腫瘤組織、脾臟內(nèi)占淋巴細(xì)胞的比例，腫瘤組、1-MT組和對(duì)照組之間無(wú)差異。在腫瘤引流淋巴結(jié)和對(duì)照淋巴結(jié)內(nèi)，CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例腫瘤組明顯低于正常對(duì)照組，但與1-MT干預(yù)組之間無(wú)明顯差異，1-MT干預(yù)組同樣明顯低

21、于正常對(duì)照組。
　　 腫瘤組織內(nèi)，CD4+CD25+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞腫瘤組明顯高于1-MT干預(yù)組。脾臟內(nèi)，CD4+CD25+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞在腫瘤組中的比例為明顯高于正常組，也明顯高于1-MT組。正常對(duì)照組和1-MT組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤引流淋巴結(jié)和對(duì)照淋巴結(jié)內(nèi)，CD4+CD25+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞在腫瘤組中的比例明顯高于正常組(P<0.001)，也明顯高于1-MT組。1-MT組仍高于正常對(duì)照組。
　

22、　 3.Western Blot
　　 結(jié)果顯示，IDO在腫瘤組和1-MT組腫瘤、脾臟、淋巴結(jié)中表達(dá)均明顯高于對(duì)照組。
　　 FoxP3在腫瘤組腫瘤、脾臟和淋巴結(jié)中的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，也明顯高于1-MT組。1-MT組與正常對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.A20 B細(xì)胞淋巴瘤是一種良好的NHL動(dòng)物模型。
　　 2.IDO在動(dòng)物模型的腫瘤、脾臟、腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)高表達(dá)，通過(guò)上調(diào)