吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制小鼠心臟移植排斥反應作用機制的研究.pdf

1、本課題旨在研究吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)在小鼠異位心臟移植排斥反應中的抑制作用及其機制，采用轉染IDO基因的供體小鼠樹突細胞(IDO+DC)與色氨酸代謝產物(TC)聯(lián)合對受體進行干預，以期使增殖T細胞在DC傳遞抗原期間處于色氨酸饑餓且TC大量累積的狀態(tài)中，造成T細胞增殖抑制或克隆刪除，檢驗在此狀態(tài)下抑制移植排斥反應的強度，為成功誘導免疫耐受提供實驗基礎。
　　 第一部分IDO+DC和TC聯(lián)合應用對T細胞的抑制作用
　

2、　 目的:研究IDO+DC和TC對體外培養(yǎng)T淋巴細胞的抑制作用。
　　 方法:通過攜帶IDO基因的腺病毒轉染供體DC而獲得IDO+DC。在體外實驗中，獲取受體脾CD4+T淋巴細胞，分別與供體DC、DC+TC、IDO+DC和IDO+DC+TC進行混合培養(yǎng)。在體內實驗中，分別向受體注射供體DC、TC、IDO+DC及IDO+DC+TC，5天后獲取受體脾CD4+T淋巴細胞，分別與供體DC進行混合培養(yǎng)。IDO+DC+TC注射組獲取的受體

3、脾CD4+T淋巴細胞再分別與供體DC和第三系DC進行混合培養(yǎng)。各組均檢測T細胞凋亡率及增殖刺激指數(shù)(SI)。
　　 結果:在體外實驗中，與IDO+DC+TC混合培養(yǎng)的受體T細胞SI明顯降低，而T細胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)。在體內實驗中，注射IDO+DC+TC的受體T細胞SI亦明顯降低，而T細胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)。供體DC刺激的IDO+DC+TC注射組T細胞SI較第三系DC的SI低，而其T細胞凋亡率明顯升高，差

4、異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論:聯(lián)合應用IDO+DC及TC較單獨給予這兩種干預因素對T淋巴細胞具有更強的抑制作用，并有可能誘導針對供體的抗原特異性免疫抑制。
　　 第二部分小鼠同種異位心臟移植模型的建立
　　 目的:建立穩(wěn)定、可靠的小鼠同種異位心臟移植模型，為體內實驗結果的準確性提供保障。
　　 方法:通過顯微外科技術分兩階段建立該動物模型，第一階段為模型制作訓練階段，第二階段為穩(wěn)定階段

5、，并對麻醉方式、供心處理等方面進行相應改進。
　　 結果:穩(wěn)定階段進行手術80例，手術成功率(91.25％)較訓練階段(29％)明顯提高(P＜0.01)，且兩階段中無一動物死于麻醉意外。模型穩(wěn)定階段中，血管吻合失敗率、移植心缺血時間及手術時間等較訓練階段均明顯縮短(P＜0.01)。
　　 結論:長期進行顯微外科技術訓練對避免實驗動物的浪費和保障后續(xù)實驗結果的準確性具有重要的意義。成功的麻醉是手術成功的前提，提高血管吻合質

6、量是手術成功的關鍵，此模型穩(wěn)定可靠，是研究器官移植排斥反應的理想動物模型。
　　 第三部分IDO+DC和TC聯(lián)合應用對小鼠異位心臟移植排斥反應的抑制作用及其機制研究
　　 目的:研究聯(lián)合應用供體IDO+DC和TC對移植排斥反應的抑制作用，探討IDO抗排斥反應的作用機制。
　　 方法:術前給予受體不同干預，包括注射PBS、未轉染DC、空病毒轉染DC、CsA(10mg/kg/d)、TC、IDO+DC、IDO+DC+T

7、C等。觀察移植物存活時間。術后7天獲取移植物行組織病理學檢查、qRT-PCR檢測細胞因子和IDO mRNA的表達水平、Western Blot及免疫組化染色檢測IDO蛋白的表達水平。獲取受體外周血行流式細胞學檢測T細胞凋亡率。
　　 結果:與PBS組、未轉染DC組、空病毒轉染DC組比較，TC和IDO+DC組的供心生存期明顯延長(P＜0.01)，病理分級程度下降(P＜0.05)，IDOmRNA和蛋白表達水平明顯增高（P＜0.01）

8、，TNF-αmRNA的表達量降低(P＜0.05)，而IL-10 mRNA和蛋白表達水平增高(P＜0.05)，且T細胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)。與TC和IDO+DC組比較，IDO+DC+TC組供心生存期延長(P＜0.05)，IDOmRNA和蛋白表達水平增高(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ、TNF-αmRNA的表達量均降低（除與IDO+DC組相比IL-2mRNA下降無統(tǒng)計學差異，P＜0.05），IL-10mRNA和蛋白表達水均增

9、高(P＜0.05)，T細胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)，而病理分級程度雖有所降低但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結論:術前注射轉染IDO基因的供體DC及TC對小鼠心臟移植排斥反應的抑制作用較單獨應用這兩種干預因素更強，表明IDO通過色氨酸耗竭和色氨酸代謝產物累積兩條途徑同時發(fā)揮抗排斥作用。
　　 第四部分IDO+DC和TC聯(lián)合應用抑制排斥反應的抗原特異性研究
　　 目的:觀察聯(lián)合應用轉染IDO基因的供體

10、DC和TC對小鼠心臟移植后皮膚移植排斥反應的抑制作用。
　　 方法:按第三部分方法建立IDO+DC+TC實驗組，對其中供心存活超過30天的受體分別進行供體來源和第三系來源的皮膚移植，觀察移植皮片的存活情況及病理學表現(xiàn)。
　　 結果:供體來源的移植皮片在術后兩周仍存活，僅出現(xiàn)輕度的皮膚卷邊和毛發(fā)脫落，皮下組織少量炎性細胞浸潤。而第三系來源的移植皮片在術后十天已完全結痂、脫落，皮下組織大量炎性細胞浸潤。
　　 結論: