吲哚胺2，3雙加氧酶轉染小鼠乳腺癌4T1細胞后的表達及作用.pdf

1、目的:
　　 通過建立小鼠乳腺癌模型研究吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)在乳腺癌遠處轉移過程中發(fā)揮的作用及可能機制。
　　 檢測IDO轉染小鼠乳腺癌4T1細胞后的表達和意義。檢測轉染后的4T1細胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用,尋找二者之間的聯(lián)系,并探討其引起轉移的可能機制。
　　 方法:
　　 1.建立4T1小鼠乳腺癌遠處轉移模型,半定量RT-PCR法、Wes

2、ternblot和免疫組化法檢測未轉移和轉移小鼠腫瘤組織中IDO的表達情況。
　　 2.通過轉染攜帶IDO基因的目的質粒建立高表達IDO的小鼠乳腺癌4T1細胞系,半定量RT-PCR和Westernblot檢測轉染后的4T1細胞中IDO的表達；轉染后的4T1細胞與小鼠脾臟T細胞共孵育,流式細胞儀檢測T細胞凋亡的比例；Westernblot法檢測共孵育后的T細胞Fas/FasL與Bcl-2/Bax基因的表達情況。
　　 結果

3、:
　　 1.半定量RT-PCR法檢測示4T1細胞不表達IDO,IFN-γ刺激也不能明顯上調(diào)IDO的表達。
　　 2.免疫組化法示發(fā)生轉移小鼠乳腺原發(fā)癌[(12.40±5.15)％]和轉移癌中[(14.28±6.46)％]IDO的陽性細胞指數(shù)均高于未發(fā)生轉移小鼠乳腺癌組織[(3.16±1.63)％](P<0.05),發(fā)生轉移小鼠乳腺癌轉移灶中IDO的表達水平高于原發(fā)癌,但沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。半定量RT-PCR

4、法和Westernblot結果與免疫組化結果一致。
　　 3.調(diào)取IDO基因編碼序列(CDS)區(qū)域,克隆至pMD19-Tsimple載體中并測序后連入真核表達載體pIRES2-EGFP。BglⅡ/SalⅠ雙酶切重組質粒pIRES2-EGFP-IDO,驗證連接成功。
　　 4.將IDO真核表達載體pIRES2-EGFP-IDO通過脂質體轉染小鼠乳腺癌4T1細胞,以轉染空質粒組為對照。半定量RT-PCR法和Westernbl

5、ot檢測示轉染目的基因后的4T1細胞系IDO有表達,而轉染對照質粒后的4T1細胞系和未轉染的4T1細胞系IDO無表達。
　　 5.將脂轉目的基因、對照質粒和未轉染的4T1細胞分別與小鼠脾臟分離T細胞共孵育,同時留取未共孵育的T細胞作對照,流式細胞儀檢測T細胞的凋亡率。共同培養(yǎng)48小時后,流式細胞儀檢測結果顯示與轉染目的基因IDO的4T1細胞共培養(yǎng)的CD3+T細胞(pIRES2-IDO-4T1/Tcells,以后均用此代指)凋亡率

6、為(47.07±6.13)％；與對照質粒(pIRES2-EGFP-4T1/Tcells,以后均用此代指)和未轉染的4T1細胞(4T1-Tcells,以后均用此代指)共培養(yǎng)后的凋亡率分別為(35.56±4.26)％和(32.41±6.38)％；而正常培養(yǎng)的CD3+T細胞(simple-Tcells,106/mL,以后均用此代指)的凋亡率為(12.40±3.40)％。組間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05),而pIRES2-EGFP-4T1/T

7、cells和4T1-Tcells的凋亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05),pIRES2-IDO-4T1/Tcells出現(xiàn)較為明顯的細胞凋亡。
　　 6.留取pIRES2-IDO-4T1/Tcells、pIRES2-EGFP-4T1/Tcells、4T1-Tcells和simple-Tcells這四組小鼠脾臟T細胞,分別檢測其Fas/FasL與Bcl-2/Bax蛋白的表達情況。Westernblot法檢測結果顯示Fas、FasL和Ba

8、x的蛋白表達在pIRES2-DO-4T1/Tcells、pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這三組T細胞中均有增加,其中pIRES2-IDO-4T1/Tcells這一組表達高于其它組(P<0.05),pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這兩組組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),simple-Tcells這一組表達最低。而Bcl-2的蛋白表達在pIRES2-IDO-4T1/Tc

9、ells、pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這三組T細胞中均有降低,其中pIRES2-IDO-4T1/Tcells這一組表達低于其它組(P<0.05),pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這兩組組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),simple-Tcells這一組表達最高。
　　 結論:
　　 1.發(fā)生轉移的乳腺原發(fā)癌和轉移癌中IDO的表達水平均高于未發(fā)生轉移