吲哚胺2,3-雙加氧酶轉染骨髓間充質干細胞誘導移植免疫耐受的實驗研究.pdf

1、背景:隨著各種新型免疫抑制劑的問世，移植外科技術的進步，器官移植已經成為了治療器官功能衰竭最佳的方案。然而，器官移植術后長期、量使用免疫抑制劑所導致的嚴重副作用（如重癥感染、骨髓抑制、糖代謝紊亂等）卻顯著影響了移植受體的長期生存。因此，如何誘導受體產生供體特異性免疫耐受，減少免疫抑制劑的大量使用，成為了移植免疫界一直以來的研究重點。
　　結合既往研究結果，上述問題的關鍵可能在于野生型骨髓間充質干細胞的免疫抑制作用相對低下。因此，如

2、何增強骨髓間充質干細胞的免疫抑制作用，使其在安全劑量范圍內即可達到理想的免疫抑制效應;增強骨髓間充質干細胞的免疫抑制作用后是否可誘導受體免疫耐受形成，成為了本實驗的研究的方向。
　　目的:通過慢病毒轉染技術，將兔源性IDO基因轉入兔骨髓間充質干細胞內，增強MSCs的免疫抑制作用，誘導CD4+CD25+ Tregs生成。并通過上調Tregs對抑制性協(xié)同刺激分子CTLA-4及免疫抑制性細胞因子IL-10、 TGF-β的表達，提升Tre

3、gs的抗原特異性免疫抑制作用，從而防治急性排斥反應，誘導供體特異性移植免疫耐受的形成。
　　方法:
　　1.兔骨髓間充質干細胞的分離與培養(yǎng):
　　因家兔屬嚙齒科動物，各品系遺傳穩(wěn)定，且便于腎移植手術的實施，故本研究采用家兔骨髓間充質干細胞及移植模型作為研究對象。骨穿針穿取兔股骨獲得骨髓懸液。密度梯度離心法獲取骨髓懸液中單個核細胞層。于DMEM/F12完全培養(yǎng)基內貼壁生長兩天后去除懸浮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)七天后傳代。
　

4、　2.攜帶IDO基因慢病毒的構建:
　　GenBank搜索獲得兔源性IDO基因序列信息。RT-PCR擴增、純化IDO序列。酶切消化慢病毒載體質粒GV218后，將擴增的IDO序列與之拼接，挑選陽性克隆(pGC-FU-GFP-IDO)。純化的陽性克隆質粒與載體質粒pHelper1.0及pHelper2.0共同轉染入293細胞內，使目的基因與慢病毒載體在293細胞內重組整合為攜帶IDO基因的慢病毒(pGC-FU-GFP-IDO lent

5、ivirus)。
　　3.慢病毒感染骨髓間充質干細胞:
　　感染前12小時消化調整MSCs密度為4.5×103/孔，將其于六孔板內貼壁培養(yǎng)12小時后加入1ml含ploy brene的增強感染液及空載慢病毒(pGC-FU-GFP lentivirusMOI=100)或IDO陽性慢病毒(pGC-FU-GFP-IDO lentivirus MOI=120)。待細胞貼壁長滿后加入20ug Fe/ml Molday ION Rhoda

6、mine B繼續(xù)培養(yǎng)12小時。消化上述MSCs并制懸，以備動物模型注射使用。
　　結果:
　　1.兔骨髓間充質干細胞的分離與培養(yǎng):
　　采集的骨髓細胞經培養(yǎng)3小時后開始貼壁，48小時后貼壁細胞變形，呈典型的紡錘體狀或纖維細胞樣生長。培養(yǎng)六天后原代MSCs融合達80％，予傳代。傳代細胞培養(yǎng)三天后，細胞融合即可達80％以上，可穩(wěn)定傳代生長。
　　2.IDO基因慢病毒的構建及MSCs轉染:
　　質粒載體GV218

7、經AgeI酶切后，加入擴增IDO序列（PCR產物大小:1243bp）構建重組質粒。重組質粒轉染293T細胞后于細胞內合成陽性克隆慢病毒并分泌于外周培養(yǎng)基內。收集病毒上清并提純，最終病毒滴度檢測結果為2×108 TU/ml。
　　第三代(P3) MSCs按MOI=100及120分別感染空載病毒pGC-FU-GFP及IDO陽性病毒pGC-FU-GFP-IDO24小時后，于倒置熒光顯微鏡下觀察到貼壁細胞發(fā)出淺淡綠色熒光，細胞感染率20％

8、-30％。96小時后熒光強度達峰，80％以上MSCs高強度表達綠色熒光蛋白。
　　3.IDO慢病毒轉染MSCs穩(wěn)定高表達IDO蛋白:
　　慢病毒轉染MSCs全細胞裂解后經免疫蛋白印跡(Westernblot)分析，在500IU/mlIFN-γ作用下，野生型及空載病毒轉染MSCs極低水平表達IDO蛋白，而pGC-FU-GFP-IDO病毒轉染MSCs可穩(wěn)定高表達IDO蛋白（分子量大小43KDa）。
　　結論:
　　1

9、、慢病毒載體可將兔源性IDO基因成功轉入兔骨髓間充質干細胞，并使兔骨髓間充質干細胞穩(wěn)定、持續(xù)、高水平表達IDO蛋白。
　　2、IDO轉染骨髓間充質干細胞后，可增強骨髓間充質干細胞對效應性T細胞的直接免疫抑制作用。
　　3、IDO轉染骨髓間充質干細胞后可增強骨髓間充質干細胞誘導CD4+CD25+ Tregs生成的作用。同時，IDO轉染的骨髓間充質干細胞通過上調Treg表達的CTLA-4及IL-10、TGF-β而增強Tregs的

10、抗原特異性免疫抑制效應。
　　4、IDO轉染的骨髓間充質干細胞可通過誘導CD4+CD25+ Tregs的生成并增強Tregs的免疫抑制作用，一定程度內減輕急性排斥反應，延長受體生存時間，誘導部分受體形成供體特異性移植免疫耐受。
　　綜上所述，慢病毒介導的基因轉染技術可有效將兔源IDO基因轉入兔骨髓間充干細胞內，并使其高水平表達IDO蛋白，從而增強骨髓間充質干細胞的免疫抑制作用，誘導CD4+CD25+ Tregs生成，并增強C