創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠額葉VDR表達(dá)變化的研究.pdf

1、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是精神障礙類疾病。近些年，隨著自然災(zāi)害、恐怖活動(dòng)和涉及個(gè)人生命安全事件的頻發(fā)，其發(fā)病率也在升高。PTSD病程很長(zhǎng)，也難以治愈，給家庭和社會(huì)帶來(lái)很大的負(fù)擔(dān)，這些特點(diǎn)引起人們對(duì)其越來(lái)越關(guān)注。目前，對(duì)PTSD還沒(méi)有統(tǒng)一的定義，其發(fā)病機(jī)制也未闡明，但有關(guān)學(xué)者普遍認(rèn)為導(dǎo)致PTSD發(fā)病的神經(jīng)基礎(chǔ)可能是神經(jīng)元之間的突觸效能的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。
　　目的：
　

2、　1，25-二羥維生素D[1，25-Dihydroxyvitamin D，1，25-(OH)2D]是神經(jīng)甾體激素，借助于維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、保護(hù)神經(jīng)和參與神經(jīng)免疫的功能。VDR在額葉、海馬結(jié)構(gòu)和中腦內(nèi)都有表達(dá)，且與神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。因此，其在有關(guān)腦區(qū)表達(dá)量的異?？赡軐?dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)退行性障礙。單程長(zhǎng)時(shí)應(yīng)激(single prolonged stress paradigm，SPS)

3、是公認(rèn)的建立PTSD大鼠模型的方法。本實(shí)驗(yàn)SPS方法建立PTSD大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)分析PTSD大鼠額葉VDR的表達(dá)變化情況，討論VDR與PTSD發(fā)病機(jī)制是否有相關(guān)性，力爭(zhēng)為探索PTSD發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　一、PTSD大鼠模型制備與實(shí)驗(yàn)分組
　　制備模型:成年的雄性SD大鼠，體重200-250g，全身束縛禁錮2小時(shí)后，馬上強(qiáng)迫游泳20min（水深40cm，水溫25℃），SD大鼠經(jīng)過(guò)15min的休息，乙

4、醚麻醉至意識(shí)喪失。
　　實(shí)驗(yàn)分組:PTSD模型大鼠隨機(jī)分成4組:1d、3d、7d、14d組;未造模大鼠作為對(duì)照組。
　　二、行為學(xué)檢測(cè)
　　各組大鼠先后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)估SPS對(duì)大鼠焦慮行為的影響。
　　三、取材
　　將大鼠麻醉、生理鹽水灌注，而后斷頭取額葉腦組織，-70℃凍存?zhèn)溆?WesternBlot和RT-PCR)。
　　四、Western Blot
　　取大鼠額葉腦組織

5、，剪碎裂解放置24h(4℃)，離心(12000 r/min，30 min、4℃)，取上清，蛋白定量。而后依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(兔抗鼠多克隆抗體VDR，1∶500)4℃過(guò)夜、二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶5000）37℃孵育1h、ECL發(fā)光顯色和分析凝膠成像圖像及統(tǒng)計(jì)。參照物選用抗GAPDH抗體。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量是該目的蛋白與相應(yīng)GAPDH蛋白的灰度比值。
　　五、RT-PCR
　　大鼠額葉腦組織，提取總RN

6、A，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增完成后進(jìn)行RT-PCR。
　　六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用GraphPad Prim6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（x)±s）表示。各組VDR的比較采用單因素方差分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:1d、3d、7d、14d組大鼠與對(duì)照組相比，在中心區(qū)域，停留的時(shí)間和運(yùn)動(dòng)的距離依次縮減，即實(shí)驗(yàn)

7、組大鼠焦慮、恐懼等情緒反應(yīng)的程度隨時(shí)間的遞增，呈上升趨勢(shì)。
　　高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:1d、3d、7d和14d組大鼠與對(duì)照組相比，進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)依次減少，而進(jìn)入非開(kāi)放臂的次數(shù)依次增多，即實(shí)驗(yàn)組大鼠焦慮、恐懼等情緒反應(yīng)的程度隨時(shí)間的遞增，呈上升趨勢(shì)。
　　二、Western Blot
　　Western Blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，在1d、3d和7d組大鼠，腦組織VDR蛋白的表達(dá)水平均有所增加，其中7d組VDR

8、蛋白表達(dá)顯著增加;而14d組大鼠腦組織VDR表達(dá)水平下降，與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;1d、3d和7d組腦組織VDR蛋白表達(dá)大致呈逐漸上升趨勢(shì)，但3d與7d組之間VDR蛋白表達(dá)無(wú)差異。
　　三、RT-PCR
　　RT-PCR結(jié)果顯示:1d、3d和7d組與對(duì)照組相比VDR mRNA表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)，其中7d組VDR mRNA表達(dá)量最顯著;14d組VDR mRNA表達(dá)水平同對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果與Wes