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文檔簡介
1、創(chuàng)傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)是精神障礙類疾病。近些年,隨著自然災害、恐怖活動和涉及個人生命安全事件的頻發(fā),其發(fā)病率也在升高。PTSD病程很長,也難以治愈,給家庭和社會帶來很大的負擔,這些特點引起人們對其越來越關注。目前,對PTSD還沒有統(tǒng)一的定義,其發(fā)病機制也未闡明,但有關學者普遍認為導致PTSD發(fā)病的神經(jīng)基礎可能是神經(jīng)元之間的突觸效能的長時程增強。
目的:
2、 1,25-二羥維生素D[1,25-Dihydroxyvitamin D,1,25-(OH)2D]是神經(jīng)甾體激素,借助于維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、保護神經(jīng)和參與神經(jīng)免疫的功能。VDR在額葉、海馬結構和中腦內(nèi)都有表達,且與神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育有關。因此,其在有關腦區(qū)表達量的異??赡軐е律窠?jīng)系統(tǒng)退行性障礙。單程長時應激(single prolonged stress paradigm,SPS)
3、是公認的建立PTSD大鼠模型的方法。本實驗SPS方法建立PTSD大鼠模型,通過檢測分析PTSD大鼠額葉VDR的表達變化情況,討論VDR與PTSD發(fā)病機制是否有相關性,力爭為探索PTSD發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
方法:
一、PTSD大鼠模型制備與實驗分組
制備模型:成年的雄性SD大鼠,體重200-250g,全身束縛禁錮2小時后,馬上強迫游泳20min(水深40cm,水溫25℃),SD大鼠經(jīng)過15min的休息,乙
4、醚麻醉至意識喪失。
實驗分組:PTSD模型大鼠隨機分成4組:1d、3d、7d、14d組;未造模大鼠作為對照組。
二、行為學檢測
各組大鼠先后進行曠場實驗和高架十字迷宮實驗,評估SPS對大鼠焦慮行為的影響。
三、取材
將大鼠麻醉、生理鹽水灌注,而后斷頭取額葉腦組織,-70℃凍存?zhèn)溆?WesternBlot和RT-PCR)。
四、Western Blot
取大鼠額葉腦組織
5、,剪碎裂解放置24h(4℃),離心(12000 r/min,30 min、4℃),取上清,蛋白定量。而后依次進行電泳、轉膜、封閉、一抗(兔抗鼠多克隆抗體VDR,1∶500)4℃過夜、二抗(HRP標記羊抗兔IgG,1∶5000)37℃孵育1h、ECL發(fā)光顯色和分析凝膠成像圖像及統(tǒng)計。參照物選用抗GAPDH抗體。目的蛋白的相對表達量是該目的蛋白與相應GAPDH蛋白的灰度比值。
五、RT-PCR
大鼠額葉腦組織,提取總RN
6、A,反轉錄合成cDNA,擴增完成后進行RT-PCR。
六、統(tǒng)計學處理
采用GraphPad Prim6.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,所有實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差((x)±s)表示。各組VDR的比較采用單因素方差分析。以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果:
一、行為學檢測結果
曠場實驗結果顯示:1d、3d、7d、14d組大鼠與對照組相比,在中心區(qū)域,停留的時間和運動的距離依次縮減,即實驗
7、組大鼠焦慮、恐懼等情緒反應的程度隨時間的遞增,呈上升趨勢。
高架十字迷宮實驗結果顯示:1d、3d、7d和14d組大鼠與對照組相比,進入開放臂的次數(shù)依次減少,而進入非開放臂的次數(shù)依次增多,即實驗組大鼠焦慮、恐懼等情緒反應的程度隨時間的遞增,呈上升趨勢。
二、Western Blot
Western Blot結果顯示:與對照組相比,在1d、3d和7d組大鼠,腦組織VDR蛋白的表達水平均有所增加,其中7d組VDR
8、蛋白表達顯著增加;而14d組大鼠腦組織VDR表達水平下降,與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異;1d、3d和7d組腦組織VDR蛋白表達大致呈逐漸上升趨勢,但3d與7d組之間VDR蛋白表達無差異。
三、RT-PCR
RT-PCR結果顯示:1d、3d和7d組與對照組相比VDR mRNA表達水平明顯增高(P<0.05),其中7d組VDR mRNA表達量最顯著;14d組VDR mRNA表達水平同對照組相比沒有統(tǒng)計學差異。該結果與Wes
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