創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠齒狀回VDR表達(dá)變化的研究.pdf

1、前言
　　創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumaticstressdisorder，PTSD)是指?jìng)€(gè)體由于經(jīng)歷對(duì)生命具有威脅的事件或嚴(yán)重的創(chuàng)傷，導(dǎo)致系列精神癥狀長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙。報(bào)道顯示遭受自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭(zhēng)、暴力等人口的8-13％由于引發(fā)PTSD后而出現(xiàn)精神癥狀，且發(fā)生率在不斷上升。PTSD癥狀一般在遭受創(chuàng)傷后數(shù)日甚至數(shù)月后出現(xiàn)。目前，PTSD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，神經(jīng)元之間的突觸效能的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)可能是應(yīng)激導(dǎo)致焦慮和條件性恐懼記憶的

2、神經(jīng)基礎(chǔ)。
　　作為神經(jīng)甾體激素，維生素D通過維生素D受體（vitaminDreceptor，VDR）介導(dǎo)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)免疫功能。VDR是核受體，在大腦皮質(zhì)和海馬中均有表達(dá)，VDR與神經(jīng)退行性癡呆癥相關(guān)聯(lián)，也可能導(dǎo)致焦慮和運(yùn)動(dòng)障礙。本實(shí)驗(yàn)擬通過單程長(zhǎng)時(shí)應(yīng)激（singleprolongedstressparadigm，SPS）建立PTSD大鼠模型，觀察大鼠齒狀回VDR的表達(dá)變化情況，討論VDR在PTSD發(fā)病機(jī)制中的作用

3、，力爭(zhēng)為PTSD防治新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法
　　一、PTSD大鼠模型制備與實(shí)驗(yàn)分組
　　雄性SD大鼠(200-250g)，禁錮2小時(shí)后，立即強(qiáng)迫游泳20min（水深40cm，水溫25℃）。經(jīng)過15min的恢復(fù)，乙醚麻醉至意識(shí)喪失。
　　將PTSD模型大鼠隨機(jī)分為4組:SPS1d、SPS3d、SPS7d、SPS14d組，正常飼養(yǎng)大鼠作為對(duì)照組。
　　二、行為學(xué)檢測(cè)
　　SPS7d組大鼠與對(duì)

4、照組大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)和高架十字迷宮試驗(yàn)，評(píng)估SPS對(duì)大鼠焦慮行為的影響。
　　三、取材
　　將各組大鼠麻醉，生理鹽水或4％多聚甲醛灌注，斷頭取腦，6只大鼠大腦用4％多聚甲醛浸泡固定備用（免疫組織化學(xué)），另六只大腦取齒狀回，-70℃凍存?zhèn)溆?WesternBlot和RT-PCR)。
　　四、免疫組織化學(xué)
　　4％多聚甲醛固定組織24小時(shí)，30％蔗糖溶液沉糖12小時(shí)后切片，切片厚度約7μm;根據(jù)S-P試劑盒說明書操作

5、，進(jìn)行VDR免疫組織化學(xué)染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后晾干，室溫保存。
　　五、WesternBlot
　　大鼠齒狀回組織，剪碎裂解過夜，4℃離心(12000r/min，30min)，取上清。進(jìn)行蛋白定量后，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(兔抗鼠多克隆抗體VDR，1∶500)4℃過夜，二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶5000）37℃孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)分析。對(duì)照選用抗GAPDH抗體。

6、目的蛋白與相應(yīng)GAPDH蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　六、RT-PCR
　　大鼠齒狀回組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增完成后進(jìn)行RT-PCR。
　　七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示。各組VDR的比較采用單因素方差分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

7、>　　曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，SPS7d組大鼠在中心停留的時(shí)間、在中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)的距離均顯著減少。
　　高架十字迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，SPS7d組在開放臂停留時(shí)間及進(jìn)入開放臂次數(shù)顯著減少。
　　二、免疫組織化學(xué)
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SPS大鼠齒狀回VDR蛋白表達(dá)出現(xiàn)一過性升高，在SPS7d組VDR蛋白表達(dá)達(dá)到最高。
　　三、WesternBlot
　　WesternBlot結(jié)果顯示

8、:SPS大鼠齒狀回VDR蛋白表達(dá)出現(xiàn)一過性升高，在SPS7d組VDR蛋白表達(dá)達(dá)到最高，與免疫組化結(jié)果一致。
　　四、RT-PCR
　　RT-PCR結(jié)果顯示:SPS大鼠齒狀回VDRmRNA表達(dá)出現(xiàn)一過性升高，在SPS7d組VDRmRNA表達(dá)達(dá)到最高，與免疫組化及WesternBlot結(jié)果一致。
　　結(jié)論
　　PTSD大鼠齒狀回VDR表達(dá)呈一過性增高，SPS后第七天達(dá)到峰值，之后逐漸下降。
　　PTSD大鼠行為