若干鈣調(diào)控蛋白在小鼠ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及神經(jīng)發(fā)生中的作用.pdf

1、鈣離子在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum,ER)膜之間的流動(dòng)對(duì)神經(jīng)元的基礎(chǔ)功能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)存細(xì)胞器,參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣平衡,調(diào)控各種信號(hào)通路,介導(dǎo)細(xì)胞蛋白合成、信號(hào)傳導(dǎo)等過程。本實(shí)驗(yàn)以小鼠胚胎干(embryonicstem,ES)細(xì)胞體外定向分化神經(jīng)元為模型,模擬胚胎神經(jīng)發(fā)育過程,考察若干鈣調(diào)控蛋白在小鼠ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及神經(jīng)發(fā)生中的作用。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離

2、子動(dòng)態(tài)平衡過程由蘭尼堿受體(ryanodinereceptors,RyRs)、IP3受體(inositol1,4,5-triphosphatereceptors,IP3Rs)以及肌(內(nèi))質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmiCreticulumCa2+-ATPase,SERCA)協(xié)調(diào)運(yùn)作控制。其中,SERCA蛋白能量依賴性的鈣回調(diào)作用對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣平衡至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)考察了ES細(xì)胞神經(jīng)元分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及鈣釋放特征,并探索SE

3、RCA在神經(jīng)元功能性發(fā)育中潛在作用及可能的分子機(jī)制。
　　 Junctophilins(JPs)是一類被證實(shí)存在于興奮期細(xì)胞中的C2+平衡調(diào)控蛋白,神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)Junctophilin3(JP-3),Junctophilin4(JP-4)兩種亞型。Jp-3,Jp-4基因敲除小鼠特征性表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能失常、平衡能力損傷并伴有記憶損傷。本研究利用ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元模型,探索Jp-3,Jp-4在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中的作用。

4、>　　 目的:探索小鼠胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及鈣釋放特征,并探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵蛋白SERCA在神經(jīng)元功能性發(fā)育中潛在的作用。
　　 方法:采用經(jīng)典的4-/4+法誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元,10-7mol/L全反式維甲酸(Retinoicacid,RA)為陽(yáng)性對(duì)照,0.1％二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對(duì)照。在分化培養(yǎng)終點(diǎn)(貼壁鋪展培養(yǎng)d8+10),光鏡和免疫熒光成像法鑒定神經(jīng)元形成(軸突長(zhǎng)度是胞體長(zhǎng)度的3倍及以上

5、),細(xì)胞微管蛋白(β-tubulinⅢ)陽(yáng)性。分別收集ES細(xì)胞、擬胚體(embryoidbodies,Ebs)、貼壁培養(yǎng)d8+0、d8+5和d8+10細(xì)胞樣本,以RT-PCR及Western-blot法,評(píng)價(jià)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)鈣調(diào)控蛋白R(shí)yRs、IP3受體及SERCA在各個(gè)神經(jīng)分化時(shí)期表達(dá)特征。以神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白(nestin),成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白(β-tubulinⅢ),神經(jīng)軸突標(biāo)志蛋白(neurofilaments,NEFM)和神經(jīng)樹突

6、標(biāo)志蛋白(microtubule-associatedprotein2,MAP2)表達(dá)評(píng)價(jià)分化情況;FM1-43熒光染色觀察分化成熟神經(jīng)元囊泡攝取功能。選取分化早期d8+3神經(jīng)前體細(xì)胞及d8+10分化成熟神經(jīng)元,經(jīng)由活細(xì)胞工作站檢測(cè)其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放功能。以10-6mol/L,SERCA抑制劑(cyclopiazonicacid,CPA)論證SERCA對(duì)神經(jīng)分化的特定作用。觀察CPA是否影響RA促神經(jīng)分化作用及神經(jīng)元囊泡攝取功能。同時(shí)利用W

7、estern-blot法檢測(cè)MAPK通路中ERK,INK,p38磷酸化等相關(guān)分子事件的變化,以探索RA促神經(jīng)分化過程SERCA的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:小鼠ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣相關(guān)蛋白SERCA、RyRs和IP3Rs表達(dá)均隨分化時(shí)相依賴性上調(diào)。神經(jīng)前體細(xì)胞即具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放功能,成熟神經(jīng)元中此功能進(jìn)一步增強(qiáng)。SERCA抑制劑CPA能顯著減少RA促ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞,抑制神經(jīng)元軸突和樹突發(fā)育,并抑制神經(jīng)元囊泡

8、攝取功能。提示SERCA具有調(diào)控神經(jīng)分化作用,特別體現(xiàn)在促軸突和樹突發(fā)育以及囊泡攝取功能。CPA可下調(diào)MAPK通路中ERK,JNK和p38的磷酸化,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存對(duì)神經(jīng)分化調(diào)節(jié)作用尚伴隨MAPK家族蛋白的激活。
　　 結(jié)論:RA促小鼠ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)過程,呈現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及釋放功能,該功能存在于神經(jīng)細(xì)胞分化早期,且隨分化進(jìn)程呈上調(diào)趨勢(shì)。抑制SERCA鈣離子泵功能,不僅降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存,尚呈現(xiàn)抑制神經(jīng)分化作用,特別是影響軸突

9、和樹突發(fā)育,并抑制了神經(jīng)囊泡攝取功能。神經(jīng)分化過程中SERCA活性伴有MAPK家族蛋白磷酸化參與。
　　 第二章Jp-3,Jp-4基因?qū)π∈驟S細(xì)胞衍生神經(jīng)元胚層發(fā)育、線粒體表達(dá)及神經(jīng)遞質(zhì)分泌的影響
　　 目的:探索ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元Ca2+平衡調(diào)控蛋白基因(Junctophilin3,Junctophilin4,Jp-3,Jp-4),在神經(jīng)分化中的作用,及其與神經(jīng)元線粒體功能和神經(jīng)遞質(zhì)分泌功能的關(guān)系。
　　 方

10、法:小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化早期,小干擾Jp-3,Jp-4(siRNA),收集鋪展分化培養(yǎng)d8+0、d8+2、d8+6、d8+8各時(shí)期細(xì)胞樣本,RT-PCR法考察分化相關(guān)基因DCT3/4(未分化ES細(xì)胞標(biāo)志基因)、Fgf5(外胚層發(fā)育標(biāo)志基因)、Brachy(中胚層發(fā)育標(biāo)志基因)、AFP(內(nèi)胚層發(fā)育標(biāo)志基因)、nestin(神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志基因)的表達(dá)。貼壁培養(yǎng)d8+0、d8+5、d8+10(神經(jīng)分化終點(diǎn))各時(shí)期,評(píng)價(jià)線粒體融合蛋白基因Mf

11、n1、Mfn2,過氧化物酶增殖激活受體輔酶激活因子PGC1-α及核呼吸因子NRF-1的表達(dá)特征。MitoTracker*Red標(biāo)記活細(xì)胞線粒體,細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)siJp-3,Jp-4神經(jīng)元線粒體完整性。RT-PCR法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞分化終點(diǎn)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)志性蛋白泡狀谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicularglutamatetransporters,VGluT1),谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase65,GAD65),乙酰膽

12、堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:siJp-3,siJp-4可顯著降低外胚層Fgf5轉(zhuǎn)錄,部分減少神經(jīng)前體細(xì)胞nestin轉(zhuǎn)錄,對(duì)其他胚層相關(guān)基因表達(dá)則影響不明顯。siJp-3,siJp-4尚可損傷線粒體完整性,表現(xiàn)為線粒體熒光強(qiáng)度降低,且在軸突和樹突內(nèi)分布減少。siJp-3,siJp-4抑制了線粒體結(jié)構(gòu)與功能基因Mfn1、Mfn2、PGC1-α及NRF-1的轉(zhuǎn)錄。同時(shí),siJp