內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分
　　 醛固酮誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及相關(guān)機制研究
　　 目的：
　　 腎小管上皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞萎縮、壞死在醛固酮致腎損傷中起著越來越重要的作用。本研究期望探討其內(nèi)在機制及氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在醛固酮致腎損傷中的作用。
　　 方法：
　　 1.體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，細(xì)胞同步化后給予不同濃度醛固酮(Aldosterone)刺激，應(yīng)用熒光顯微鏡定性觀察活性氧(ROS)表達情

2、況；免疫熒光酶標(biāo)儀定量檢測活性氧(ROS)表達；應(yīng)用激光共聚焦，形態(tài)學(xué)觀察腎小管上皮細(xì)胞凋亡；Annexin V/propidium iodide雙染后，流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞凋亡情況；Real-time PCR、Western blot法檢測糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein78，GRP78)和CHOP表達水平。
　　 2.體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，細(xì)胞生長融合至50％時，向6孔板中分別

3、轉(zhuǎn)入500 nM CHOP特異性干擾RNA(CHOP siRNA)和空載對照干擾RNA(Vehicle siRNA)，處理24小時后根據(jù)不同分組，分別向6孔板中加入醛固酮(100 nM)或抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(5 mM)(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，Annexin V/propidium iodide雙染后，流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　 3.體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，細(xì)胞同步

4、化后給予醛固酮(100 nM)刺激干預(yù)，根據(jù)不同分組加入NAC(5 mM)和空載，Western blot法檢測GRP78和CHOP表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度的醛固酮能夠劑量依賴性、濃度依賴性的誘導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生；流式細(xì)胞術(shù)顯示不同劑量的醛固酮能夠顯著增加腎小管上皮細(xì)胞凋亡；Western blot法顯示醛固酮能夠劑量依賴性、時間依賴性的增加GRP78表達水平；Real-time PCR顯示醛固酮能夠

5、劑量依賴性增加CHOP基因表達(P<0.05)。
　　 2.醛固酮(100 nM)能夠顯著增加腎小管上皮細(xì)胞凋亡，CHOP siRNA和抗氧化劑NAC能夠明顯緩減醛固酮誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.醛固酮(100 nM)能夠顯著增加腎小管上皮細(xì)胞中GRP78和CHOP蛋白表達水平，而抗氧化劑NAC干預(yù)后能夠明顯緩減GRP78和CHOP蛋白表達(P<0.05)。
　　 結(jié)論

6、：
　　 醛固酮能夠分別誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，ROS介導(dǎo)的，CHOP轉(zhuǎn)錄因子依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路在醛固酮致腎小管上皮細(xì)胞凋亡中起著重要作用。
　　 第二部分
　　 抗氧化劑NAC對醛固酮致腎損傷大鼠的保護作用及機制研究
　　 目的：
　　 觀察醛固酮致腎損傷模型中是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活及抗氧化劑NAC對醛固酮所致腎損傷的保護作用及可能相關(guān)機制。
　　 方法：

7、r>　　 30只雄性SD大鼠于實驗前兩周行右腎切除手術(shù)。兩周后大鼠隨機分為以下4組：對照組(0.5％乙醇，皮下微泵埋置，n=6)；1％NaCl組(1％NaCl飲水，0.5％乙醇，皮下微泵埋置，n=8)；醛固酮處理組(1％NaCl飲水，醛固酮，0.75μg/h，皮下微泵埋置，n=8)；NAC干預(yù)組(1％NaCl飲水，醛固酮，0.75μg/h，皮下微泵埋置，NAC100 mg/kg/day灌胃，n=8)。每周測量大鼠尾動脈血壓；每周使用代

8、謝籠收集24小時尿液。建模4周后腹腔麻醉大鼠，腹主動脈采血檢測肌酐水平；腎組織固定、切片后行PAS染色觀察腎臟病理變化；(TdT)-Mediated dUTPNick-End Labeling(TUNEL)法檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡；比色法測定大鼠血清中脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物丙二醛MDA以及超氧化物歧化酶SOD的含量；酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)表達水平；Western blot法檢測腎組織中糖調(diào)節(jié)蛋白(glucos

9、e-regulated protein78，GRP78)和CHOP表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 與對照組及1％NaCl組大鼠比較，醛固酮處理組大鼠4周時尾動脈血壓、尿蛋白明顯增高，病理顯示腎小球系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多，系膜區(qū)明顯擴張超過毛細(xì)血管袢，TUNEL顯示腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯增多；而抗氧化劑NAC能夠顯著降低大鼠血壓和蛋白尿，減少小管細(xì)胞凋亡，改善腎功能。同樣相似的結(jié)果顯示：醛固酮處理組大鼠與對照組及