人尿源性干細胞的分離培養(yǎng)及向神經細胞定向分化的體內外實驗研究.pdf

1、研究背景及研究目的:
　　中樞神經系統(tǒng)損傷的治療一直是世界性難題，通過移植干細胞替代受損神經細胞繼而重建神經功能的治療方法越來越受到重視。研究表明移植神經干細胞(Neural Stem Cells，NSCs)治療中樞神經系統(tǒng)損傷均具有一定療效，但是NSCs來源有限、分離和培養(yǎng)均相當困難，移植NSCs又存在醫(yī)學倫理限制、免疫排斥和存活率低等問題。而間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)來源廣泛、分離培

2、養(yǎng)技術成熟、無倫理限制和低免疫原性，但MSCs的獲取手段多為有創(chuàng)的。
　　人尿源性干細胞(human urine-derived stem cells，hUSCs)是從尿液中分離出的多能干細胞，來源不受局限且安全無創(chuàng)，具有廣闊的臨床應用前景?，F階段國內外對其研究甚少，目前研究證實hUSCs具有MSCs的類似特性:表達類似的膜表面標志物及具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞和脂肪細胞的潛能。然而目前尚未見hUSCs向神經細胞定向

3、分化的相關報道，本實驗旨在體外分離培養(yǎng)hUSCs，觀察其生物學特性，并于體外和體內鑒定其向神經細胞分化的能力，為將來利用干細胞移植治療中樞神經系統(tǒng)損傷疾病尋找新的“種子細胞”來源。
　　方法:
　　1、建立體外分離培養(yǎng)hUSCs的技術并觀察其生物學特性
　　1.1利用LMM101培養(yǎng)基貼壁篩選法分離培養(yǎng)hUSCs;
　　1.2 MTT法觀察細胞增殖能力;
　　1.3流式細胞術檢測表面抗原CD29、CD90、

4、CD44、CD45、CD34、CD73和CD133等的表達情況;
　　1.4采用成脂和成骨誘導培養(yǎng)基分別對hUSCs進行體外誘導，并采用油紅O和茜素紅染色進行鑒定;
　　2、體外誘導hUSCs向神經細胞定向分化
　　采用成神經誘導培養(yǎng)基對hUSCs進行神經定向誘導，實時定量熒光PCR(q-PCR)檢測Nestin、Sox2、GFAP、β-tubulinⅢ、NSE和MAP2 mRNA的表達變化，細胞免疫熒光染色檢測Nes

5、tin、Sox2的表達情況。
　　3、體內移植GFP-hUSCs，觀察hUSCs在大鼠腦內增殖分化情況
　　利用水凝膠負載GFP-hUSCs移植到大鼠模型的腦損傷區(qū)，熒光顯微鏡下觀察腦內GFP表達陽性細胞的分布情況，細胞免疫熒光染色檢測Nestin、GFAP和β-tubulinⅢ的表達情況。
　　結果:
　　1、成功建立了從人新鮮尿液中分離培養(yǎng)hUSCs的技術
　　hUSCs細胞于接種后3-7 d開始貼壁，

6、7-10d細胞呈集落生長，10-15 d不同細胞克隆呈現4種不同形態(tài):“鋪路石”上皮細胞樣、長梭形肌細胞樣、扁圓形內皮細胞樣和短梭形成纖維細胞樣，經過2-3周的傳代培養(yǎng)后P4代細胞形態(tài)呈較為均一的成纖維細胞樣，細胞傳至P10余代，仍然保持旺盛的增殖能力。
　　2、hUSCs的生物學特性
　　2.1 MTT法檢測細胞增殖能力的結果顯示hUSCs生長曲線呈S形。
　　2.2流式細胞術檢測結果顯示分離得到的hUSCs CD4

7、4、CD29、CD90和CD73表達陽性，CD34、CD133和CD45表達陰性，表明其與間充質干細胞表達類似的細胞表面標志物。
　　2.3體外采用成脂和成骨誘導培養(yǎng)基分別對hUSCs誘導14d和21d后，油紅O和茜素紅染色均為陽性，表明hUSCs體外具有成脂和成骨的分化潛能。
　　3、體外誘導hUSCs向神經細胞定向分化
　　q-PCR結果顯示hUSCs經神經定向誘導培養(yǎng)7d后Nestin、Sox2、MAP2、NSE

8、、GFAP表達分別上調8.08±0.95倍、3.75±0.88倍、5.12±0.46倍、2.08±0.11倍和5.60±1.86倍，誘導12d后分別上調4.47±0.62倍、5.69±0.92倍、2.52±0.61倍、1.63±0.13倍和5.97±0.89倍(P＜0.05);細胞免疫熒光染色檢測結果顯示經神經誘導7d后Nestin、Sox2陽性細胞率分別為17.2±0.58％和15.3±1.32％，誘導12d時陽性細胞率分別為62.5

9、±4.48％和33.7±2.76％(P＜0.05)，結果表明hUSCs體外具有分化為神經細胞的潛能。
　　4、GFP-hUSCs腦內增殖分化狀況
　　GFP-hUSCs于移植1W和3W后，發(fā)現宿主腦內存在GFP陽性細胞，同時部分GFP陽性細胞從腦損傷區(qū)遷移至海馬區(qū)，并且表達GFAP和β-tubulinⅢ，說明移植細胞能夠于宿主腦內成功存活、遷移并分化為神經細胞。
　　結論:1、本研究成功建立了從人新鮮尿液中分離培養(yǎng)并大