新福林和貝特舒對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加劇，受到青光眼等眼部疾病困擾的患者越來越多，其相應(yīng)的治療藥物在眼科臨床中得到了廣泛應(yīng)用。而眼表直接給藥的方式易導(dǎo)致藥物被角膜吸收而引起角膜損傷，主要是通過作用于角膜細(xì)胞引起的。人角膜基質(zhì)細(xì)胞（Human corneal stromal cells，HCS細(xì)胞）在靠近前彈力層處分布較多，對(duì)維持角膜的正常結(jié)構(gòu)和生理功能起關(guān)鍵作用，因此研究眼科藥物對(duì)HCS細(xì)胞的影響作用對(duì)眼科藥物的臨床安全應(yīng)用、低毒藥物篩選體系的建立

2、以及新型無毒眼科藥物的研發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)意義。截止到目前，關(guān)于擴(kuò)瞳用擬腎上腺素藥新福林和治療青光眼用抗腎上腺素藥貝特舒對(duì)HCS細(xì)胞的毒性作用尚未見報(bào)道，本文以本實(shí)驗(yàn)室自建的非轉(zhuǎn)染無致瘤性HCS細(xì)胞系為體外研究體系對(duì)新福林和貝特舒的凋亡誘導(dǎo)作用及其細(xì)胞與分子機(jī)理進(jìn)行研究。
　　為了研究新福林對(duì)HCS細(xì)胞的毒性影響、凋亡誘導(dǎo)作用及其細(xì)胞與分子機(jī)理，本文將臨床濃度為100g/L的新福林經(jīng)倍比稀釋至0.78125g/L作用于HC

3、S細(xì)胞，通過光鏡觀察、細(xì)胞活力和細(xì)胞周期檢測(cè)觀察其對(duì)HCS細(xì)胞的影響，光鏡觀察結(jié)果顯示濃度高于0.78125 g/L的新福林可導(dǎo)致HCS細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)空泡化、生長(zhǎng)增殖異常等變化并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明濃度高于1.5625 g/L的新福林均可引起HCS細(xì)胞的細(xì)胞活力下降，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明6.25 g/L的新福林引起HCS細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，這說明了新福林對(duì)HCS細(xì)胞具有毒性作用。細(xì)胞活力下降和細(xì)胞周期受阻均與

4、細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系，為了檢測(cè)新福林對(duì)HCS細(xì)胞的毒性作用是否引起HCS細(xì)胞的凋亡，本文對(duì)其質(zhì)膜通透性變化、磷脂酰絲氨酸外翻、DNA斷片化和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)，質(zhì)膜通透性檢測(cè)結(jié)果顯示濃度高于3.125 g/L的新福林均對(duì)質(zhì)膜通透性產(chǎn)生了顯著影響，6.25 g/L的新福林可導(dǎo)致HCS細(xì)胞發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻和DNA斷片化，且伴隨胞質(zhì)空炮化、核固縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體等典型凋亡結(jié)構(gòu)特征出現(xiàn)，說明了新福林對(duì)HCS細(xì)胞確實(shí)具有凋亡誘導(dǎo)作用。細(xì)胞

5、凋亡可以通過幾個(gè)途徑起作用且有很多凋亡蛋白的參與，為了進(jìn)一步研究新福林引起HCS細(xì)胞凋亡的細(xì)胞與分子機(jī)理，本文對(duì)6.25 g/L新福林處理的HCS細(xì)胞進(jìn)行了Bcl-2家族蛋白的表達(dá)、線粒體膜電位和Caspase-3，8，9活性的檢測(cè)。Bcl-2家族蛋白的檢測(cè)顯示新福林引起HCS細(xì)胞促凋亡蛋白Bad和Bax表達(dá)升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)下降，線粒體膜電位發(fā)生去極化，且Caspase-8，9，3活性先后均增大，揭示新福林通

6、過線粒體途徑和死亡受體途徑共同作用調(diào)控HCS細(xì)胞的凋亡。
　　為了研究貝特舒對(duì)HCS細(xì)胞的毒性影響、凋亡誘導(dǎo)作用及其細(xì)胞與分子機(jī)理，本文將臨床濃度為2.8 g/L的貝特舒經(jīng)倍比稀釋至0.04375 g/L作用于HCS細(xì)胞，光鏡觀察結(jié)果顯示濃度高于0.0875g/L的貝特舒可導(dǎo)致HCS細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)空泡化、生長(zhǎng)增殖異常等變化并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明濃度高于0.0875g/L的貝特舒均可引起HCS細(xì)胞的細(xì)胞

7、活力下降，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明0.7 g/L的貝特舒引起HCS細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，這說明了貝特舒對(duì)HCS細(xì)胞具有毒性作用。進(jìn)一步研究其凋亡誘導(dǎo)作用，質(zhì)膜通透性檢測(cè)結(jié)果顯示濃度高于0.0875 g/L的貝特舒均對(duì)質(zhì)膜通透性產(chǎn)生了顯著影響，6.25 g/L的貝特舒可導(dǎo)致HCS細(xì)胞發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻和DNA斷片化，且伴隨胞質(zhì)空炮化、核固縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體等典型凋亡結(jié)構(gòu)特征出現(xiàn)，說明了貝特舒對(duì)HCS細(xì)胞確實(shí)具有凋亡誘導(dǎo)作用。Bcl-2家

8、族蛋白的檢測(cè)顯示貝特舒引起HCS細(xì)胞促凋亡蛋白Bad和Bax表達(dá)升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)下降，線粒體膜電位發(fā)生去極化，且Caspase-9，3活性先后均增大，揭示貝特舒對(duì)HCS細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用具有線粒體依賴性。
　　綜上所述，在人角膜基質(zhì)細(xì)胞系的體系中新福林和貝特舒均具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，且具有濃度和時(shí)間依賴性，新福林是通過線粒體途徑和死亡受體途徑的共同作用實(shí)現(xiàn)的，貝特舒是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎